[谈健脾解毒方对人胃癌裸鼠皮下移植瘤微血管生成的影响]健脾

谈健脾解毒方对人胃癌裸鼠皮下移植瘤微血管生成的影响

1 材料与方法 1. 1 实验材料 1. 1. 1 动物及细胞株BALB /c 裸小鼠，雄性，4～6 周龄，体质量( 18 2) g， SPF 级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号: SCXK( 沪) 2012-0002。人胃低分化腺癌MKN45 细胞株，由上海中医药大学附属曙光医院 肿瘤实验室提供。

1. 1. 2 药物与试剂健脾解毒方( 由生黄芪、白术、薏苡仁、野葡萄藤、八 月札等组成) ，醇提物由上海中医药大学中药学院制备及进行质量控制;
5-氟尿 嘧啶( 5-Fu) ，购自齐鲁制药( 海南) 有限公司( 批号: H20093079) ;
RPMI-1640 培养基和胎牛牛血清，均购自Gibco 公司;
胰蛋白酶，购自美国Sigma公司;
CD34 抗体，购自美国RD 公司;
血管内皮生长因子( VEGF) ELISA 试剂盒，购自上海 博谷生物科技有限公司。

1. 2 胃癌移植瘤模型建立及分组给药按照我们以前文献中报道的方法，用 PBS 将人胃癌细胞制成浓度为1 107 /ml，以每只0. 2 ml 注射裸鼠腋下，建立人 胃癌裸鼠皮下移植瘤模型。待肿瘤生长至100 ～ 300 mm3，选择符合实验标准 的荷瘤鼠60 只，随机分为5 组: 即模型组、5-Fu 组及健脾解毒方低、中、高剂 量组，每组12 只。健脾解毒方低、中、高剂量组分别灌胃250、500、1 000 mgkg - 1d - 1 的健脾解毒方醇提物悬浊液，每日1 次，共给药21 d;
5-Fu 组腹腔注射给 药，30 mg /kg，每日1 次，共给药5 d;
模型组灌胃等体积生理盐水。1. 3 检测项目与方法每隔2 d 测量裸鼠肿瘤大小。给药第21 天后，每组 取6 只摘除眼球取血，并取出瘤体测量肿瘤大小及质量;
每组剩余6 只小鼠用于 观察生存时间。

1. 3. 1 肿瘤体积、肿瘤抑制率及荷瘤鼠生命延长率的计算肿瘤体积( TV) = ab2 /2，其中a、b 分别表示肿瘤的长、短径;
瘤重抑制率= ( l - 药物干预组平均 瘤重/模型组平均瘤重) 100%;
生命延长率( %) = ( T /C - 1) 100%，其中T 代表药 物干预组小鼠的平均生存时间，C 代表模型组小鼠的平均生存时间。

1. 3. 2 免疫组化方法检测肿瘤组织微血管密度情况按照我们以前文献报 道的方法，取瘤体组织，采用4 m 连续切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水。将切 片依次经内源性过氧化物酶清除、抗原修复、血清封闭、抗体结合、DAB 染色、 蒸馏水洗涤;
再经苏木素衬染，烟酸酒精分化，稀氨水蓝化。递增梯度酒精脱水， 二甲苯透明，常规树脂封片。所用一抗为1 ∶ 50 稀释的CD34 抗体，二抗为1 ∶ 200 生物素标记二抗，显色时加入1 ∶ 200 辣根酶标记链霉卵白素，3种试剂均 以磷酸盐缓冲液稀释。微血管密度( MVD) 计数按Weidner 法进行: CD34 阳性以 血管内皮细胞呈棕色或棕黄色染色为标准;切片在100 倍光镜下挑选微血管分布 最高密度区域，在200 倍光镜下计数不重复视野中被CD34 染成棕黄色的微血管 数，取其平均值作为MVD。每个与邻近微血管明显分离的阳性染色的血管内皮 细胞或血管内皮细胞簇都视为独立的微血管;
只要结构不相连，其分支结构也计 作一个血管计数。

1. 3. 3 ELISA 法检测裸鼠血清VEGF 表达将经眼球静脉丛取出的小鼠全 血离心后，收集血清。采用VEGF ELISA 试剂盒测定各组小鼠血清VEGF 的表 达情况，具体检测方法参照试剂盒说明书进行。将检测结果用ELISA 标准曲线 专用软件作出VEGF浓度的标准曲线，分别根据标准曲线计算出各检测孔中 VEGF 的浓度。

1. 4 统计学方法数据以x s 表示，采用SPSS18. 0 统计软件包进行统计分 析。两独立样本均数比较采用Independent-Samples T Test，多样本均数比较采用 单因素方差分析，均数间两两比较采用SNKq检验，生存分析采用Kaplan-Meier 方 法。检验以P 0. 05 为差异有统计学意义。

2 结果2. 1 对裸鼠人胃癌肿瘤生长的影响与模型组比较，各药物干预组的瘤体质 量均有不同程度减轻( P 0. 01) ，其中健脾解毒方中、高剂量组在瘤体质量及抑 瘤率方面均与低剂量组有显著性差异( P 0. 01) ，表明健脾解毒方能够呈剂量依 赖性地抑制裸鼠人胃癌皮下移植瘤的生长，且健脾解毒方高剂量组与5-Fu 组的 作用无统计学差异( P 0. 05) 。

2. 2 对胃癌裸鼠生存期的影响观察结果显示，各药物干预组荷瘤鼠中位生 存时间均较模型组明显延长( P 0. 01) ，健脾解毒方低、中、高剂量和5-Fu对荷瘤 鼠均有一定的生命延长作用，并且健脾解毒方中、高剂量组荷瘤鼠中位生存时间 和生命延长率方面均与健脾解毒方低剂量组有显著性差异( P 0. 01) 。这表明健 脾解毒方能够延长荷瘤裸鼠的生存时间，且具有一定的量效关系。

各组裸鼠荷 瘤生存期比较( n = 6) 2. 3 对人胃癌荷瘤鼠MVD 和VEGF 表达的影响免疫组化及ELISA 法检 测结果显示，健脾解毒方低、中、高剂量组和5-Fu 组均能显著降低MVD、下调 裸鼠血清中VEGF 表达水平，与模型组比较差异均有统计学意义( P 0. 01) ;
其中 健脾解毒方中、高剂量组作用明显优于健脾解毒方低剂量组( P 0. 01) 。表明健 脾解毒方能够抑制裸鼠人胃癌VEGF 表达和微血管的形成，且呈一定剂量依赖性。

3 讨论 实体肿瘤无控制地侵袭性生长是恶性肿瘤的主要特征，其与肿瘤组织中新 生血管的生成密切相关。肿瘤血管新生或血管生成是实体瘤生长的关键因素，而 且是肿瘤细胞侵袭转移的必需条件。肿瘤血管生成受血管生成因子和血管生成抑 制因子的两者有机调控: 一旦血管生成因子上调或血管生成抑制因子功能障碍， 二者平衡被打破即发生肿瘤血管新生。

VEGF 及其相关受体是介导肿瘤组织内及周围新生血管形成的关键因素， 是刺激肿瘤血管生成的最强的、特异性最高的促血管生长因子之一。VEGF与其 受体结合引起受体自身磷酸化，激活丝裂原活化的蛋白激酶，增强血管内皮细胞 有丝分裂，刺激内皮细胞增殖并促进血管形成;
并能增强血管尤其是微小血管的 渗透性，使血浆蛋白等大分子外渗沉积在血管外的基质中，为新生毛细血管网建 立提供营养。VEGF 的高表达与肿瘤微血管密度、恶性程度、患者预后不良密切 相关，VEGF 检测已广泛应用于诸多肿瘤疾病的病情评估。多项研究结果显示， VEGF 在胃癌组织的阳性表达率明显高于相应癌旁组织，并且VEGF 高表达的 胃癌患者与其组织学分级、浸润深度、淋巴结转移、TNM 分期密切相关。胃癌的病变过程复杂，我们经过大量临床观察和实践证实脾虚湿热蕴结是胃癌发生发 展的重要原因，并提出健脾解毒的治法，代表方剂为健脾解毒方。该方由黄芪、 党参、白术、薏苡仁、猪苓、石见穿等组成。黄芪补气健脾;
白术、薏苡仁、猪 苓健脾利湿;
石见穿、野葡萄藤、八月札解毒理气。全方具有益气补脾、解毒利 湿功效，且药简力专，驱邪不伤正，扶正不助邪。我们临床研究表明，健脾解毒 方联合化疗能够改善患者临床症状，延长患者生存期，减轻化疗毒副作用，抑制 胃癌术后患者复发转移率，并可显著下调肿瘤患者血清中VEGF 的表达。前期的 实验研究表明，健脾解毒方可减少幽门螺杆菌诱发C57BL /6 小鼠胃癌过程中 MVD，抑制VEGF、Ang-2 和Tie-2 的表达，且对结肠癌小鼠肿瘤血管新生有明 显的抑制作用，这可能是其防治胃癌的重要机制之一;
体外实验也证实其可抑制 H.pylori 诱导的人胃癌MKN45 细胞VEGF 表达。本研究通过建立裸鼠人胃癌移 植瘤模型，研究发现健脾解毒方低、中、高剂量组均可抑制裸鼠人胃癌移植瘤生 长，延长荷瘤鼠中位生存时间，与模型组比较差异有统计学意义;
健脾解毒方低、 中、高剂量组血清VEGF 表达和肿瘤组织MVD 均较模型组明显降低，呈一定的 剂量依赖效应。综上所述，健脾解毒方能够抑制裸鼠胃癌生长，延长生存期，其 机制可能与抑制VEGF 表达进而抑制肿瘤微血管生成有关。