VEGFR3胞外区基因真核表达载体的构建:真核表达载体有哪些

VEGFR3胞外区基因真核表达载体的构建

【关键词】 vegfr  3;
淋巴生成;
真核表达 construction and identification of eukaryotic expression vector of vegfr  3 extracellular domain gene chen yan, wang xi  cai, wu zhi  ping, jin cong  guo, gu yu  lan, zhou yong  chun, liu xin the third affiliated hospital of kunming medical college，tumor institute of yunnan tumor hospital, kunming 650118, china corresponding author: wang xi  cai, e  mail:wangxc2005323@126.comabstract：objective to construct the pcdna3.1  vr  3 eukaryotic expression vector for vegfr  3 extracellular domain gene. the expression and identification of the vector was carried out in vitro. methods the extracellular domain of vegfr  3 encoding sequence was amplified by reverse transcriptase  polymerase chain reaction from c57bl/6 mice embryo and cloned into the hindⅲ  xbaⅰ sites of pcdna3.1. after confirmed by sequencing the recombinant plasmid pcdna3.1  vr  3 was transfected into cos  7 cells and its protein expression was identified by western blot. results the extracellular domains of vegfr  3 encoding sequence was successfully cloned from c57bl/6 mice embryo. and the pcdna3.1  vr  3 eukaryotic expression vector was constructed, which can be expressed in cos  7. conclusion we successfully constructed the pcdna3.1  vr  3 eukaryotic expression vector which may pave a way for further studies in animals experiment. key words：vegfr  3;
lymphangiogenesis;
eukaryotic expression 淋巴转移是恶性肿瘤转移的一个重要途径。WWW.133229.cOm有无淋巴 结转移及转移淋巴结的数目一直被认为是决定肿瘤患者临床分期、治疗方案制订和预后评估的重要因素之一。

血管内皮细胞生长因子受体  3 (vascular endothelial growth factor receptor 3, vegfr  3) 通过与血管内皮细胞生长因子  c,d(vascular endothelial growth factor  c,d, vegf  c,d)特异性结合可诱导淋巴管和血管生成，对肿瘤的生长和转 移起重要调控作用[1  2]。针对vegfr  3及其配体vegf  ｃ或vegf  d信号转导通 路的抗体、药物和疫苗的研究，成为当前肿瘤生物治疗研究的热点和方向。

vegfr  3是一种典型的跨膜镶嵌蛋白, 由胞外区、跨膜区、胞内区三部分 构成。

胞外区由7个免疫球蛋白样超二级结构域组成，其第ⅱ个免疫球蛋白区是 配体的结合位点，而其两翼的第ⅰ区和第ⅲ区对于两者结合的亲和力具有重要调 节作用。

我们以vegfr  3为靶点，构建了vegfr  3胞外区真核表达载体 pcdna3.1  vr  3，并在体外进行了表达检测，为探索肿瘤生物治疗新的切入点奠 定基础。

1 材料与方法 1.1 菌株、细胞株、实验动物和质粒 大肠杆菌dh5α菌株由中国医学科学院医学生物研究所提供；
cos  7细胞株 购自gibco公司；
实验动物c57bl/6孕鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公 司，spf级，合格证号为“scxk（京）2002  0003”；
pcdna3.1质粒购自invitrogen公 司。

1.2 主要试剂和仪器 低熔点琼脂糖、 预染sds  蛋白分子量标准、蛋白含量检测试剂盒购自 bio  rad公司；
蛋白胨、酵母提取物购自oxoid公司；
限制性内切酶hindⅲ、xba ⅰ购自promega公司；
trizol试剂、lipofectamine试剂购自invitrogen公司；
rt  pcr 试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自qiagen公司；
dl2000分子量标准、 dna连接酶试剂盒购自takara公司；
generulertmdna分子量标准为bbi公司产品；
羊 抗鼠vegfr  3抗体购自abcam公司；
兔抗羊igg购自chemicon公司；
protein detectertm elisa试剂盒购自kpl公司；
硝酸纤维素膜、ecl显色试剂盒购自biosciences 公司。pcr仪为mj research公司产品，凝胶成像系统为syngene公司产品，电泳仪 为bio  rad公司产品，低温高速离心机购于heraeus公司，二氧化碳培养箱、生物 安全柜、超低温冰箱均为forma公司产品。

1.3 重组质粒pcdna3.1  vr  3的构建 使用trizol试剂提取总rna。核酸蛋白定量仪(bio  rad)测定rna纯度， 1％琼 脂糖凝胶电泳检测总rna完整性。

以gene bank vegfr  3（gi 6679812） 胞外区cdna序列为目的基因，使用 primer premier 5.00引物设计软件，设计如下引物，p1的5′端所带限制性酶切位点 为hindⅲ，p2的5′端所带限制性酶切位点为xbaⅰ：
上游引物p1：5′  aagcttgccaccatgggt tactccatgacccctc  3′ 下游引物p2：5′  gctctagattaactccat gctgcctttatc  3′ rt  pcr扩增目的片段，扩增条件：50℃逆转录30min，95℃灭活逆转录酶 和预变性15min，94℃变性40s，54℃退火1min，72℃延伸2min，38个循环后72℃ 延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳，以确定反应产物大小是否为所需目的片段。

hindⅲ和xbaⅰ双酶切目的片段与pcdna3.1，回收纯化后进行dna连接反应。

连接产物转化大肠杆菌dh5α，氨苄青霉素筛选阳性克隆。挑取阳性单菌落接种于 5ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃，250r/min振摇培养至对数生 长后期；
提取重组质粒dna，hindⅲ和xbaⅰ酶切鉴定后，送beckmon公司测序证 实。

1.4 重组质粒转染细胞以及表达产物的鉴定 将处于对数期的cos  7细胞接种于细胞培养瓶和6 孔培养板，加入重组质 粒pcdna3.1  vr  3与脂质体混合物。置co2培养箱中培养6h后，吸出培养液，加 入新鲜的dmem培养液继续培养48h。

用0.25%胰酶消化cos  7细胞，收集转染细胞，进行western blot分析，其 中一抗为羊抗鼠vegfr  3多克隆抗体，二抗为hrp标记的兔抗羊igg。使用ecl显色试剂盒，加入化学发光试剂后，显影、定影、并照相。

2 结果 2.1 重组质粒pcdna3.1  vr  3的构建 rt  pcr扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下可见，约2 250bp处有 一条特异性条带，见图1，与目的片段大小一致。

1: dna marker（dl2000）;
2: rt  pcr product 图1 rt  pcr 扩增产物电泳 fig 1 agarosegel electrophoresis of rt  pcr product 随机挑取转化成功的单菌落，抽提质粒，进行hindⅲ和xbaⅰ酶切鉴定， 电泳后可见约2 250bp的插入片段，见图2。

dna测序结果经genebank blast分析，与已报道的vegfr  3胞外cdna序列相符， 插入片段读框正确。

2.2 重组质粒转染cos  7细胞表达产物的鉴定 重组质粒和pcdna3.1经脂质体转染真核细胞cos  7， western blot检测发现， 转染重组质粒的细胞提取物有一条特异的条带， 分子量在90kd左右， 而转染空 质粒的细胞提取物则没有条带， 见图3。

3 讨论 目前，抗血管生成治疗方面的研究已较深入，但单纯抗肿瘤血管生成治疗 并未达到抗肿瘤转移的预期效果[3]。其原因主要是由于肿瘤生物学特性的复杂 性和多态性，而且转移的发生是一个多因素、多环节参与的调控过程，仅仅阻断 某一条途径并不能完全阻断肿瘤细胞远处转移。因此，抑制肿瘤淋巴道转移的研 究具有非常重要的意义。

抗肿瘤淋巴管生成治疗是目前国内外治疗肿瘤的新策略。国内外研究表明， vegfr  3信号转导通路在肿瘤淋巴管生成中起着重要作用。vegfr  3与其配体 vegf  c或vegf  d特异性结合，可促进淋巴管内皮细胞迁移，激活信号转导刺激 淋巴管内皮细胞增殖，诱导肿瘤淋巴管生成。肿瘤淋巴管生成是促进肿瘤淋巴道转移的重要因素[4  5]。临床和病理研究已经证实，淋巴道转移是大多数实体肿 瘤细胞播散的早期事件。肿瘤淋巴管密度 (lymphatic microvessel density, lmvd)、 vegfr  3等的表达与淋巴结转移、患者预后密切相关[6  7]。chen等[8]用rna干扰 技术抑制vegf  c表达，可以抑制小鼠乳腺癌淋巴道转移。上述研究结果提示， vegfr  3信号转导通路主要调控肿瘤淋巴管生成。因此，针对该通路的抗体、药 物及疫苗的研制成为当前肿瘤生物治疗研究的热点和方向[9]。

目前，阻断该通路的策略主要包括单克隆抗体[10]、可溶性 vegfr  3  ig[11]、抑制剂[12]等。利用主动免疫打破对自身抗原的耐受是肿瘤治 疗一个很有潜力的策略。由于dna疫苗能同时诱导体液免疫和细胞免疫，被广泛 运用于感染性疾病和肿瘤免疫治疗。真核表达载体是dna疫苗的主体，其中启动 子是影响dna疫苗表达效率最重要的因素。pcdna3.1具有cmv启动子，能刺激机体 产生较强的免疫反应，常用于dna疫苗的构建。我们以pcdna3.1为表达载体，构建 了重组质粒pcdna3.1  vr  3，经脂质体介导转染cos  7细胞，western blot检测其 蛋白表达，发现转染细胞提取物有一条特异的条带，证实重组质粒在体外真核细 胞中表达的重组蛋白具备生物学活性，为后续的动物实验研究奠定基础。

本研究为进一步制备以减毒沙门氏菌为载体的vegfr  3 dna疫苗奠定了基 础。作为dna疫苗载体的重组减毒沙门氏菌，能通过自然感染的方式，将dna疫苗 直接运送给体内的抗原递呈细胞（antigen presenting cell，apc），在黏膜和全身 淋巴组织诱发以th1型应答为主的细胞免疫和体液免疫。载体菌的成分如脂多糖 和 dna 疫苗上的免疫刺激序列等还可作为佐剂，增强免疫应答效果[13]。以重组 减毒沙门氏菌为载体制备vegfr  3 dna疫苗，可以口服给药，费用低廉，具有较 好的临床应用前景。