发酵蜈蚣粉中总黄酮类含量测定的方法学研究_总黄酮的含量

发酵蜈蚣粉中总黄酮类含量测定的方法学研究

蜈蚣为蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch)的干燥体，其辛味，性温，有毒[1]。蜈蚣作为传统中药材，具有息风止 痉、解毒散结、通络止痛的作用[2]，临床常用于治疗肿瘤、原发性高血压、糖 尿病及并发症、神经性头痛、偏头痛等[3-4]。而黄酮类化合物具有抗炎、抗氧化 压力和促进抑癌基因表达的作用[5]，因而成为人们研究的热点。通过使用球孢 白僵菌(Beauveria bassiana(Bals.)Vuill)对蜈蚣进行发酵可以提高蜈蚣中黄酮类物 质的含量，增强其解毒散结的功效，还可以较大幅度地改变药性、提高疗效、降 低毒副作用[6]。笔者通过紫外可见分光光度法对发酵蜈蚣粉总黄酮类化合物含 量进行测定，并对其方法学进行考察，旨在为今后发酵蜈蚣粉中总黄酮类化合物 药理活性研究提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 仪器。

UV9100B型紫外可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)， KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，ST 16R高速冷冻离心机(赛 默飞世尔科技(中国)有限公司)，SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有 限公司)，FA1004N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，SK-1快速混匀漩涡器 (中国深圳)，远红外辐射干燥箱(上海阳光实验仪器有限公司)，梅特勒—托利多 分析天平(上海先悦机电有限公司)。1.1.2 试剂。

芦丁对照品(中国医药上海化学试剂公司);乙醇、亚硝酸钠、六水氯化 铝、氢氧化钠等试剂均为分析纯。

1.1.3 供试品。

蜈蚣粉购自安徽亳州市(批号：20150730)，经山东中医药大学药学院 高德民副教授鉴定为少棘巨蜈蚣粉(Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch)。发 酵蜈蚣粉(批号：20150801)由山东中医药大学化学实验室自制。

1.2 试验方法 1.2.1 芦丁标准品溶液的制备。

精密称取芦丁对照品20 mg，用60%乙醇溶解后，移入100 mL容量瓶 定容至刻度线，摇匀，即得浓度为0.2 mg/mL的标准溶液，置于4 ℃冰箱保存备 用。

1.2.2 发酵蜈蚣粉的制备。

称取适量灭菌后的少棘巨蜈蚣粉，加入活的白僵菌(Beauveria bassiana(Bals.)Vuill)孢子粉混悬液(100亿/g，山东农业科学院植物保护研究所自筛 菌株——桃5)，再加入适量吐温-80助溶，用适量灭菌水将其稀释为含1×108个孢 子的混悬液，拌匀湿润，在温度25～28 ℃、湿度95%的条件下，在恒温恒湿培 养箱中发酵8 d左右，待长满菌丝后停止发酵。

1.2.3 蜈蚣粉醇提液的制备。

精密称取发酵蜈蚣粉1 g(料液比为1∶30)，加入30 mL 80%乙醇，超 声20 min，于100 ℃下回流2.5 h，进行抽滤，取上清液于8 000 r/min离心20 min， 收集上清液于50 mL容量瓶中定容，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.2.4 紫外可见分光光度法测定发酵蜈蚣粉中总黄酮类化合物。

1.2.4.1 标准曲线的绘制。

分别精密量取“1.2.1”的标准液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL试管中，先加30%乙醇至5 mL，再加5%亚硝酸钠溶液0.3 mL;摇匀后静置6 min;
然后加10%六水氯化铝0.6 mL，摇匀后静置5 min;最后加入1 mol/L氢氧化钠溶液2 mL，并用30%乙醇稀释至刻度，摇匀后于510 nm处测定其吸光度。以芦丁标准 品质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.4.2 精密度试验。

精密称取发酵蜈蚣粉2 g，按“1.2.3”的方法提取试样液并吸取此试样 液，重复取样5次，每次2 mL，分别用紫外可见分光光度法在波长510 nm下测定 其总黄酮类化合物的吸光度，方法同“1.2.4.1”，并计算相对标准误差RSD。

1.2.4.3 重现性试验。

精密称取发酵蜈蚣粉2 g，共5份，按“1.2.3”的方法提取试样液并吸取 此试样液，在波长510 nm下测定其总黄酮类化合物的吸光度，方法同“1.2.4.1”， 并根据标准曲线计算其总黄酮类化合物含量及相对标准误差RSD。

1.2.4.4 加样回收率试验。

精密称取总黄酮类化合物含量为9.090 6 mg/g的发酵蜈蚣粉约2 g，共5 份，分别加入芦丁标准品，按“1.2.3”的方法提取试样液并吸取此试样液，在波长 510 nm下测定其加样后总黄酮类化合物的吸光度，方法同“1.2.4.1”，计算总黄酮 类化合物的含量，加样回收率及相对标准误差RSD。

2 结果与分析 2.1 标准曲线 标准曲线方程为Y=1.134 9x+0.007，相关系数r=0.999 8。表明芦丁浓 度在0.02～0.10 mg/mL时，其浓度与对应的吸光度呈良好的线性关系，符合 Lambert-Beer定律，可用此计算发酵蜈蚣粉中总黄酮类化合物的含量。

2.2 精密度 由表1可知，平均吸光度为0.420 5，相对标准误差 RSD=0.740 7%，符合RSD≤5%的要求，说明该方法精密度良好。

2.3 重现性 由表2可知，平均质量比为9.091 mg/g，相对标准误差 RSD=2.007%，符合RSD≤5%的要求，说明该方法重现性良好。2.4 加样回收率 由表3可知，平均回收率为98.92%，符合回收率在95%～105%的要求， 相对标准误差RSD=1568%，符合RSD≤5%的要求，说明回收率较高。因此，该 方法可用来测定发酵蜈蚣粉中黄酮类化合物的含量。

3 结论与讨论 该试验采取的紫外可见分光光度法具有设备简单、适用性广、准确度 和精密度较高的特点，在中药总黄酮含量分析中发挥重要作用[7]。因此，该试 验对发酵蜈蚣粉中总黄酮类化合物采用紫外可见分光光度法进行研究，结果表明， 该方法精密度、重现性及回收率均在要求范围之内，可作为测定发酵蜈蚣粉中总 黄酮类化合物的有效方法，旨在为今后发酵蜈蚣粉中总黄酮类化合物药理活性研 究提供理论依据。

作者：刘春雨 王集会 来源：安徽农业科学 2016年17期