肺纤维化怎么得的【谈补肾益肺消癥方干预肺纤维化大鼠TGFβ,信号通路的作用机制】

谈补肾益肺消癥方干预肺纤维化大鼠TGFβ 信号通路的作用机制

基于中医学金水相生理论，我们制定了补肾益肺消癥的治疗法则，以经典方剂金 水六君煎为基本方，创制补肾益肺消癥方。本课题组在临床补肾益气消癥方干预 肺泡上皮细胞向成纤维细胞转化作用机制的研究中，运用补肾益肺消癥方治疗特 发性肺纤维化数百例，系统整理30 余例，初步统计结果显示临床有效率达74. 5%， 显效率34. 6%，对肺功能的改善亦有良好效果，时间肺活量FVC、肺活量VC、 弥散功能DLco 等得到明显改善，患者激素使用量和频度均明显降低。为进一步 研究补肾益肺消癥方治疗IPF 的作用机制，我们以博莱霉素致大鼠IPF 为动物模 型，观察补肾益肺消癥方对IPF 大鼠转化生长因子( transforming growth factor TGF) -b 细胞信号传导通路中关键分子表达的影响，探讨该方疗效的作用机制。

1 材料与方法 1. 1 实验材料 1. 1. 1 动物及分组清洁级SD 雄性大鼠60只，体质量180 20g，饲养于东直 门医院屏障级实验动物中心，随机分为空白组、阴性对照组、阳性对照组、中药 小剂量组、中药中剂量组和中药大剂量组6 组。

1. 1. 2 药物及试剂造模用盐酸博莱霉素15mg /瓶购自日本化药株式会社;
补肾益肺消癥方( 当归、熟地、陈皮、法半夏、浙贝母、水蛭、炙甘草)均为免 煎颗粒剂，由东直门医院药剂科提供;
醋酸地塞米松片( 天津天药药业股份有限 公司) 0. 75mg /片，Rat TGF-b1 ELISA 检测试剂盒购自上海西唐生物科技有限公 司，SYBR green PCR master mix 购自美国ABI 生物公司，Rat-b-actin-antibody、 Rat-Smad2 /3-antibody、Rat-Smad4-antibody 购自SantaCRUZ 生物公司，HRP 标 记兔抗羊IgG 二抗购自武汉博士德生物科技公司。

1. 2 IPF 动物模型制作及药物干预3. 5%水合氯醛麻醉大鼠，对照组和治疗组大鼠经气管插管，按5mg /kg 体 质量缓慢注入博莱霉素，药物注入后立即将动物直立并连续旋转，使药物均匀分 布于肺叶;
空白组经气管注入等量的生理盐水。动物造模结束后，第2 天开始药 物干预。按成人剂量的5、10、20 倍，分别灌胃给予补肾益肺消癥方，阳性对照 组按0. 05mg /kg /d 灌胃给予醋酸地塞米松片剂，空白组、阴性对照组分别给予 等量的生理盐水，连续给药28d。

1. 3 动物取材 药物干预结束后腹主动脉取血分离血清，-20℃冻存;
部分肺组织Trizol 一 步法提取总RNA;
部分肺组织机械研磨，RIPA 组织裂解液提取总蛋白;
部分肺 组织4% 多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋。

1. 4 ELISA 检测 取动物血清100ml，严格按试剂盒说明操作，稀释标准品，绘制标准曲线， 450nm 处测OD 值，根据标准曲线计算血清中TGFb1 含量。

1. 5 Real-time PCR 总RNA 经反转录成cDNA，设计特异性引物，以GAPDH 为内对照设定 相对标准曲线，根据Ct 值差异，real-time PCR 检测GAPDH 和TGFb1 受体 ( TGFb1Receptor TGFb1R) 基因的相对拷贝数，根据TGFb1R 拷贝数与GAPDH 拷贝数的比值，检测TGFb1R 基因表达量的差异。PCR 引物序列:GAPDH Forward 5-CCATGGAGAAGGCTGGG-3，Reverse 5-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3 TGFb1RForward 5- TGAGTGGCTGTCTTTTGACG -3，Reverse 5- TGGGACTGATCCCATTGATT-3 PCR引物由北京奥科生物有限公司合成。

1. 6 Western-blot 总蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后脱脂奶粉封闭;
Rat-b-actin-antibody、 Rat-Smad2 /3-antibody、Rat-Smad4-antibody 4℃孵育过夜，二抗( 1∶ 3000) 室温 孵育2h，加入化学发光底物暗室显影。以b-actin为参照，根据条带灰度比分析 Smad2 /3、Smad4 蛋白含量的差异。每组选取3 个不同的样本重复上述实验。

1. 7 HE 染色 切取0. 3mm 石蜡组织切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，苏木素染色，流动水冲洗后伊红染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微 镜下观察肺组织病理改变并拍照分析。

1. 8 统计学方法 采用SPSS 13. 0 软件进行统计分析，结果以均数 标准差( 珋x s) 表示， 多组间均数比较采用单因素方差分析，2 组间均数比较采用LSD 法，P 0. 05为 差异有统计学意义。

2 结果 2. 1 各组大鼠血清中TGF-b1 含量比较 通过ELISA 检测各组大鼠血清中TGF-b1 含量。结果显示，补肾益肺消癥 方可以明显降低IPF大鼠外周血血清中TGF-b1 含量，大剂量组效果尤为明显， 与模型组比较差异有统计学意义( P 0. 01) ，中剂量组与模型组比较差异无统计 学意义。中药大剂量组TGF-b1 含量较阳性对照组为低，效果优于阳性对照组。

2. 2 各组大鼠肺组织中TGF-b1R 基因表达的差异 Real-time PCR 实验结果显示，各组IPF 大鼠肺组织中TGF-b1R 基因表达 量经统计学分析，差异无统计学意义。鼠肺组织中Smad 2 /3 含量较正常组有所 下降;
与模型组比较，中药中剂量组和小剂量组降低较为明显，阳性对照组与模 型组比较含量有所升高。阳性对照组和中药各治疗组与模型组比较，肺组织中 Smad4含量均明显升高，以中药小剂量组升高最为明显。显示，HE 染色分析发 现，模型组大鼠肺组织中肺泡结构破坏，成纤维细胞大量增生，纤维组织呈条索 状瘢痕改变、斑块状分布。阳性治疗组和中药治疗组肺泡壁轻度增厚，肺泡结构 破坏程度较轻，存在成纤维细胞增生;
中药大剂量组纤维化程度较模型组及阳性 对照组明显改善。

3 讨论 在IPF 的发病和病情进展中，络脉痹阻、气血不荣于肺致肺脏萎缩是发生 肺纤维化的病机所在，肺络癥瘕是肺间质性纤维化的重要病理机转。补肾益肺消 癥方以经典方剂金水六君煎为基本方，加黄芪、水蛭、浙贝母等，诸药合用共奏 补肺通络、化痰消癥之功，在临床化裁治疗肺纤维化取得较好疗效。IPF 早期或 急性期病理改变主要为肺泡炎，急性炎症导致肺泡组织的损伤，启动自身免疫反应，导致血小板聚集、血块形成，血管随之舒张，通透性增强，使渗出物和粒细 胞募集于损伤部位。在炎症损伤部位，趋化因子募集炎症细胞，在有细胞碎片的 急性损伤部位和吞噬细胞清除坏死组织的区域有中性粒细胞、嗜酸性细胞、淋巴 细胞和巨噬细胞聚集。在IPF 中，特殊炎症细胞对后续发生纤维变性的作用还不 明确。许多细胞因子在不同条件下激活不同的基因表达，参与创伤修复和纤维变 性的全过程。

TGF-b 在肺纤维变性进程中发挥着重要作用。TGF-b 存在显著的前纤维 变性活性，影响成纤维细胞、巨噬细胞和肌纤维母细胞的募集、激活和增殖。激 活的TGF-b 表现出超强的生长和分化特性，刺激成纤维细胞分化和细胞外基质 蛋白的合成，通过单核细胞趋化蛋白-1 募集炎症细胞，激活T 细胞免疫应答反 应。TGF-b 与TGF-bII 型受体( TGFbRII)结合后，再激活募集TGF-bI 型受体 ( TGFbRI) 组合后形成二聚体形式的受体复合物。TGFb-RII 磷酸化TGF-bRI 的 甘氨酸-丝氨酸富集区域( GS 序列) 并活化TGF-bRI 的丝氨酸/苏氨酸活性。活化 的TGFbRI反过来又磷酸化受体相关smad 蛋白。Smad2和Smad3 是受体调节因子， 参与TGF-b 和活化素信号通路。R-Smads 和Smad4 主要位于细胞质中，它们的 活性主要受衔接蛋白调节。Smad2 和Smad3直接被TGF-bRI 磷酸化，使得构象 发生改变并从受体复合物中释放出来。Smad4 蛋白MH2 结构域识别R-SmadsC 端的磷酸丝氨酸，从而形成异质二聚体复合物( R-Smad /C-Smad) 。这些复合物 转运至细胞核，核内Smad 蛋白与同源DNA 结合，吸附力较低，但在转录共激 活因子的作用下可增强亲和性。Smad3 和Smad4 与DNA 的SBE 模序结合，而 Smad2通过与Smad4 的相互作用与DNA 结合，激活相关细胞因子的转录。

动物实验显示，激活的TGF-b 在小鼠肺组织中过度表达，伴随着严重的 间质和胸膜纤维化，主要表现为过多的胶原沉积，细胞外基质蛋白、纤维结合素、 弹力蛋白在组织中富集和肌纤维母细胞的出现。TGF-b 在炎症的消退期可以直 接诱导肺组织的纤维化，通过干预Smads 介导的信号通路，抑制TGF-b 活性， 可以明显减轻肺纤维变性。

实验结果显示，补肾益肺消癥方可以明显下调IPF 大鼠外周血血清中 TGF-b1 的含量，但对于细胞膜上受体TGF-bR1 基因表达无影响。该方可以明显 下调TGF-b 信号传导通路中关键分子Smad2、3的表达，Smad4 蛋白表达有上调 趋势。肺组织病理改变亦显示，该方可以明显抑制肺泡组织的破坏及组织纤维化 增生，延缓肺纤维化的进程。由此我们可以认为，补肾益肺消癥方可以通过调控 TGF-b 信号传导通路中关键分子基因和蛋白的表达，缓解免疫应答所导致的炎症反应及细胞外基质蛋白和胶原的沉积，从而抑制肺组织纤维化的进程，达到治 疗效果。通过调控TGF-b 信号传导通路，缓解炎症反应并抑制肺组织纤维化是 补肾益肺消癥方疗效的关键作用机制之一。