[谈宣痹洗剂中羟基红花黄色素A,的含量测定] 羟基红花黄素A

谈宣痹洗剂中羟基红花黄色素A 的含量测定

1 仪器与试药 1.1 仪器 1100 型高效液相色谱仪(UV 检测器，美国Aglient公司);AE-240 型电子天 平(瑞士Mettler 公司)。

1.2 试药 羟基红花黄色素A 对照品(中国食品药品检定研究院，批号：
111637-200502);宣痹洗剂样品(批号：121201、121202、121203)由中国中医科学 院望京医院制剂中心提供;甲醇为色谱纯，实验用水为纯净水，其他试剂均为分 析纯。

2 方法与结果 2.1 色谱条件 采用Waters Symmetry Shiled-RP18(150mm4.6mm，5 m)色谱柱，以0.1%磷 酸甲醇-0.1%磷酸(29∶71)为流动相，流速1 mL/min，检测波长403 nm，柱温25℃。2.2 对照品溶液的制备 精密称取羟基红花黄色素A 对照品适量，加25%甲醇制成每1 毫升含10.0 g 的溶液，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备 精密量取样品50.0 mL，置分液漏斗中，加水饱和正丁醇60 mL，振摇萃取 4 次，每次50 s，分取正丁醇液，蒸干，残渣加25%甲醇使溶解并转移至5 mL 棕 色量瓶中，加25%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 正丁醇萃取方法研究 以羟基红花黄色素A 的含量为指标，采用L9(34)正交设计表，以正丁醇用 量、萃取次数、振摇时间为考察因素进行正交试验，正交试验因素水平与结果见 表1~3。因素主次关系依次为正丁醇用量萃取次数振摇时间，其中正丁醇用量对 得率的影响极显著，其次为萃取次数与振摇时间， 而振摇50 s 与振摇70 s 的萃 取效果基本接近，为节省时间，故选择50 s 作为振摇时间，因此确定最佳萃取 条件为A3B3C2，即正丁醇用量60 mL，萃取4 次，每次振摇50 s。

2.5 阴性样品溶液的制备 按处方比例与工艺制备不含红花的阴性样品，按2.3项下方法制备阴性样 品溶液。在上述色谱条件下，对照品、样品及阴性样品的液相色谱图见图1。结 果表明， 样品中其他成分对羟基红花黄色素A 的测定无干扰。

3.方法学考察 3.1 线性关系考察分别精密吸取对照品溶液4、6、8、10、12、14 L，注入 高效液相色谱仪，记录峰面积。以进样量X(g)为横坐标，峰面积Y 为纵坐标绘制 标准曲线，得回归方程为Y=917.17X+0.16，r=0.9997(n=6)。结果表明，羟基红花 黄色素A 进样量在0.04~0.14 g 范围内线性关系良好。

3.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 L， 连续进样6 次，测定峰面积，RSD 为1.73%， 表明仪器精密度良好。3.3 重复性试验 精密量取样品6 份，分别按2.3项下方法，以上述最佳萃取方法制备供试 品溶液，并按2.4项下色谱条件进样20 L，测定峰面积，计算含量。结果羟基红花 黄色素A 的平均含量为0.3757 g/mL，RSD 为2.0%，表明该方法重复性良好。

3.4 稳定性试验 取同一供试品溶液， 分别于制备后0、2、4、6、8、10、12、24 h 进样 20 L，测得峰面积的RSD 为1.8%，结果表明供试品溶液在24 h 内基本稳定。

3.5 加样回收率试验 精密量取已知含量(0.3757 g/mL)的同批样品25 mL 共6 份，分别置分液漏 斗中，精密加入对照品溶液(10.02 g/mL)各1.0 mL，分别按2.3项下方法，以上述 最佳萃取方法制备供试品溶液，按2.4项下色谱条件进样20 L，计算回收率。

3.6 样品测定 取不同批次样品5 份，分别按2.3项下方法，以上述最佳萃取条件制备供 试品溶液，按2.4项下色谱条件进样20 L，以外标法计算得到其中羟基红花黄色素 A 的含量为0.39 g/mL，RSD 为1.5%。

4 讨论 羟基红花黄色素A 是红花中主要成分之一，具有活血化瘀、通脉止痛等 功效。现代研究表明，羟基红花黄色素A 可以扩张冠状动脉、改善心肌缺血， 降低血压，保护脊髓出血/再灌注损伤，具有抗凝、抗血小板聚集和血管再通作 用，能有效缓解不稳定性心绞痛(UA)、降低纤维蛋白原浓度、清除自由基、控制 心绞痛的发作及向心肌梗死的转化、抗疲劳及耐缺氧等药理作用。

目前，羟基红花黄色素A 的提取、分离以及纯化工艺得到了很大的改进， 且其在红花中含量的定量分析方法先进，体内的药物代谢方式也已明确。且其多 项药理作用虽然已有报道，但仍然是国内外研究的热点，一方面是其在靶细胞及 分子水平的作用机制尚有待于进一步深入探究;另一方面是与其他中药活性组分 的配伍所产生的新疗效及其作用机制需要在分子、细胞、整体动物多个层次予以 系统揭示。因此，这就需要对不同制剂中羟基红花黄色素A 的提取、分离、纯 化等处理手段以及含量测定进行进一步深入的研究。正交试验设计和分析方法是目前最常用的工艺优化试验设计和分析方法， 是部分因子设计的主要方法。正交试验以概率论、数理统计和实践经验为基础， 利用标准化正交表安排试验方案，并对结果进行计算分析，最终迅速找到优化方 案，是一种高效处理多因素优化问题的科学计算方法。正交设计法就是利用正交 表处理多因素多水平试验的一种科学方法。该法能以尽可能少的试验次数， 获 得最满意的试验结果，筛选出最佳试验条件， 找出影响试验结果的主要因素， 从而为在医药科学研究中多因素多水平问题提供了科学的、合理的解决途径，并 日益广泛地应用于中药研究中。在工艺条件的优选工作中具有广阔的应用前景， 只是在用正交设计法探讨工艺条件时，受测试指标及所选因素、水平的影响很大， 这样选择科学合理的测试指标、因素、水平就成了整个实验的重要步骤，对能否 获得最佳工艺参数具有重要意义。本研究以宣痹洗剂为载体，以羟基红花黄色素 A含量为考察指标，采用正交试验优化得到正丁醇最佳萃取条件为：正丁醇用量 60 mL，萃取次数4 次，振摇时间50 s， 并测得其中羟基红花黄色素A 的含量为 0.39 g/mL。

在羟基红花黄色素A 含量测定研究中，参照《中国药典》2010 年版及相 关文献，对流动相选择与比例、柱温、检测波长等因素进行了考察。因干扰峰的 存在，对流动相进行调整，经比较选定0.1%磷酸甲醇-0.1%磷酸(29∶71)为流动 相时最佳。羟基红花黄色素A 是具有单查耳酮苷类结构的化合物， 极性较强， 且呈酸性， 在流动相中加入少量磷酸以抑制其离解，可改善其峰形及分离效果。

刘亮等的研究结果表明，振摇时间对萃取效果无显著性影响，而本研究结 果却发现振摇时间对萃取效果有显著影响，这可能是因为振摇时间太短，样品溶 液不能与正丁醇充分混合，从而影响萃取效果所造成。而本研究结果亦显示振摇 时间为50 s 与70 s 时萃取效果接近， 这可能是振摇50 s 时样品即与正丁醇充分 混合，故选择50 s 作为最佳萃取时间，在节省时间的同时，达到了最佳萃取效 果。

通过预实验比对发现， 如未进行正丁醇萃取，宣痹洗剂中其他成分对羟 基红花黄色素A 的干扰明显，无法进行含量测定，从而进行萃取，而正丁醇萃 取宣痹洗剂中羟基红花黄色素A 的过程是利用羟基红花黄色素A 与杂质在水与 正丁醇2 种互不相溶的溶剂中的溶解度或分配系数之间的差异，通过多次分配而 实现分离，而羟基红花黄色素A 在水饱和正丁醇中具有较大溶解度，所以本试 验用水饱和的正丁醇作为纯化萃取的溶剂，具有纯化效果好，操作简便，用时短 等优点。且羟基红花黄色素A 是具有单查耳酮苷类结构的化合物，其分子结构中具有不稳定基团，在提取、分离、纯化过程中易发生氧化、水解、聚合等反应， 将使其结构、药理作用等发生变化。

宣痹洗剂为北京中医药十病十药入选项目，临床效果显著，但仍缺少相应 质量控制标准，尤其是对其中主成分的含量测定方法尚无相关研究，本研究对其 中羟基红花黄色素A 的含量测定方法进行了研究，为该药的质量控制提供了理 论参考。