小檗碱【小檗碱对人鼻咽癌CNE,2细胞内钙含量的影响】

小檗碱对人鼻咽癌CNE 2细胞内钙含量的影响

材料和方法 1.药品 小檗碱由本院自行采集， rpmi  1640 培养基为 gibco  brl产品；
其 余试剂均为国产分析纯。钙离子荧光指示剂：fluo  3/am为sigma公司产品，用二 甲基亚砜(dmso)配成1.0 mm浓度。

2.细胞株 人鼻咽癌cne  2 细胞株购自中科院上海生命科学院细胞库，本院传 代保存。wWW.133229.CoM 3.方法 (1)细胞培养:cne  2细胞株常规培养于含10%胎牛血清的 rpmi  1640 完 全培养液（青霉素 100 u/ml，链霉素 100 u/ml，谷氨酸 30 μg/ml）置37℃， 5%co2、 饱和湿度中培养，所有实验均在细胞处于对数生长期进行。

(2)生长抑制实验［1］：取对数生长期细胞，用完全培养液调整细胞数为1×106个/ml，接种于 96 孔板， 24 h后分别加入终浓度为：20 mg/l，40 mg/l的 小檗碱，同时设置空白对照组（加实验组等体积培养液做对照），每组6复孔。

药物作用48 h后，进行流式细胞仪检测。

(3)细胞内钙离子含量测定：①ieca测定方法［3］：用不含ca、mg的磷酸 盐缓冲液(pbs)2 ml漂洗细胞2次（1000转/分，5分钟），弃上清后，用pbs稀释， 调节cne  2细胞数为6×105/ml配成细胞悬液。取两支5 ml试管，第1支加细胞悬液 490 μl和10 μl 1.0 mm的fluo  3/am液；
第2支仅取500 μl细胞悬液，不加fluo  3/am 液，两支试管均在37℃条件下孵育30分钟，用无ca2+pbs缓冲液洗涤细胞2次，最 后加500 μl无ca2+pbs缓冲液待检。②cne  2细胞内钙离子(ieca2+)的流式细胞定 量检测:应用facscalibur型流式细胞仪(美国bd公司生产)。每份标本(包括 fluo  3/am染色管和无fluo  3/am染色管)均收检2万个cne  2细胞。激光源为488 nm氩离子激光，取数之点图x轴取前向散射(fsc)y轴取侧向散射(ssc);以组方图检 测荧光强度:荧光素fluo  3强度为x轴、y轴为细胞数。③荧光散射强度fl3  h以对 数(log值)放大,计算机存储检数据。检测条件(包括染色时间、浓度、温度及电压 等)保持稳定。以cellquestplot软件(bd公司生产)分析每例样品fluo  3/am染色管或 无fluo  3/am染色管cne  2细胞荧光强度(平均道数值)，得出每例ieca含量(以细胞 内钙离子指数表示ieca2+): ieca2+＝受fluo  3/am作用后cne  2细胞荧光强度平均道数无fluo  3/am 作用cne  2细胞荧光强度平均道数×1000 结 果 20 mg/l、40 mg/l小檗碱对人鼻咽癌细胞cne  2作用后细胞内钙离子浓 度变化，经小檗碱处理cne  2细胞内钙离子含量增多,与空白组比较有非常显著 性差异(p＜0.01)。见表1。表1 小檗碱对人鼻咽癌cne  2细胞作用后细胞内钙离 子浓度变化（略）注：与空白组比较，※p＜0.01 讨 论 小檗碱对很多肿瘤细胞生长、繁殖有抑制作用，对鼻咽癌细胞有明显 的抑制作用［1］，但作用的分子机制尚不清楚。离子钙是细胞内外ca2+唯一的 生理活性形式，作为细胞内反应的第二信使，在细胞的生理调控中起着重要的作 用。线粒体参与了肿瘤细胞增殖、凋亡的过程。在肿瘤细胞凋亡早期，线粒体首 先出现形态改变，同时它参与细胞呼吸、氧的代谢、酶活性和能量供应。这些功能与线粒体膜的通透性即跨膜电位差密切相关。线粒体以一种独特的方式调控着 与细胞凋亡有关的因子如钙离子等。线粒体释放这些因子可抑制或促进细胞凋亡， 因此，被认为是凋亡调节中心［4］。细胞内大量钙离子储存于线粒体内，钙离 子在诱导细胞凋亡中起着主要作用［2］。

本研究显示，小檗碱可上调鼻咽癌细胞cne  2内ieca2+含量，提示小檗 碱通过改变细胞内钙离子的变化影响线粒体的功能，参与肿瘤细胞增殖、凋亡的 过程，其他参与小檗碱抗鼻咽癌cne  2细胞增殖和促凋亡机制有待深入研究阐明。