转GNA基因菊花叶片离体的技巧分析 菊花叶片发黄怎么办

转GNA基因菊花叶片离体的技巧分析

【中图分类号】TU377.9+3【文献标识码】B【文章编号】 2095-3089(2012)09-0287-02 前言 菊花的转基因早在1989年就被Lemineux利用农杆菌介 导法首次获得成功,此后国内外关于菊花转基因的报道较 多,Ledger等首次详细描述了用野生菊花叶片通过农杆菌 LBA4404(含二元质粒pGA643)利用叶盘法转化菊花,获得约 1%的转化率;Renou等使用超毒力菌株EHA101,用节、节间和 叶的外植体接种后共培养一段时间,然后用潮霉素进行筛选, 获得了转基因菊花;傅荣昭等将兔防御素NP-1基因导入菊花, 获得抗卡那霉素植株;Takatsu等将水稻几丁质酶基因用农 杆菌介导法转移到菊花中,获得了3株经ELISA检测对菊花灰 霉病有及强抗性的植株①以及王关林等将雪花莲凝集素导入菊花中,获得了抗蚜虫性状的转基因菊花植株②。但是,转 基因植物存在着外源目的基因在转基因植株当代及后代中 表达水平低,遗传不稳定,甚至发生外源基因沉默等现象,这 些现象都限制了转基因植物的商品化进程,本实验用以NPT- Ⅱ为选择标记基因的转雪花莲凝集素基因的菊花克隆试管 植株为材料,测试叶片在附加卡那霉素的选择再生能力,从 而分析外源基因的表达水平,这对分析外源基因在转基因植 株种的表达规律有一定的参考作用,也对转基因菊花的组培 扩繁工作有一定的积极意义。

1材料和方法 1.1材料: 9种转GNA基因的菊花试管苗 非转基因菊花试管苗 本实验用的全部材料由辽宁师范大学植物生物技术重 点实验室提供。

1.2选择再生培养基的配制表1 MSMS0培养基的成分及母 液配制 表2 MS培养基的配制母液取用表 糖30g/L,琼脂7g/L,PH5.8 6-BA 8mg/L,IAA 0.8mg/L 灭菌温度121℃,灭菌时间20min,压力103.4kp 温度冷却至40℃左右,加卡那霉素30mg/L 1.3接种与培养: 在超净工作台上,灭菌操作分别剪取9 个克隆试管植株叶片,每株5片,从顶部第二节叶片开始,依次往下,用剪刀垂直主叶脉剪两刀,但不完全剪断,只需剪断 主叶脉即可,其他部分保持相连,然后将叶片近轴面向上平 放于培养基上,同一植株的5片叶片接种在同一瓶内,每个转 化克隆的植株做3瓶平行实验,分别编号为A、B、C。对照实 验用3株未转基因的菊花试管苗叶片,接种在选择再生培养 基中,在相同的条件下培养③④。

培养条件是在2000LX左右光照约10h/d,培养温度为 25℃左右。

1.4观察与统计: 每3天观察一次叶片变化,6周时统计不 定芽再生频率。

不定芽再生频率=再生不定芽的叶片数/接种叶片数× 100% 2结果与分析 菊花离体叶片在选择再生培养基上培养约两周87号和 72号转化克隆的菊花叶片即有少数不定芽生出,一个月后, 大部分转化克隆的菊花叶片都生出了不定芽,没有长出不定 芽的叶片切口处形成疏松膨大的愈伤组织,而对照的培养基 中一直都没有不定芽生长,切口处也有愈伤组织形成,但不 膨大。各转化克隆的不定芽再生频率及不定芽密度(同一叶 片上再生不定芽的多少见图1)见表3表3 再生频率及不定芽 密度 备注:由于不定芽的密度较大数量不易统计,故用“+” 表示叶片再生不定芽的程度表3表明非转化植株的再生频率为0,而所有被测转化克隆植株均有不定芽再生,这表明转化 植株叶片均有NPT-Ⅱ基因表达。虽然各转化克隆植株的转化 频率相差不悬殊(2号克隆除外),但在芽密度上却表现出明 显不同,这表明NPT-Ⅱ基因在不同转化植株叶片中表达水平 不同。两项指标综合分析,9个转化克隆中NPT-Ⅱ基因表达最 大的有20号、42号、72号、87号,占总克隆的4/9,表达较好 的是12号和35号,占克隆的2/9,表达较差的是6号和22号,占 2/9,2号表达水平极低,占总克隆的1/9。造成转基因菊花和 非转基因菊花叶片在相同培养基和相同培养条件下出芽情 况不同的是培养基中的卡那霉素,卡那霉素是植物遗传转化 的选择标记基因,这种选择性标记基因具有对选择性物质特 殊的抗性,使转化的细胞能在选择性培养基中继续存活生长, 而没有转化的细胞被培养基中的选择性物质抑制或杀死,从 而达到筛选的目的⑤。在转基因植物的不同克隆型植株的培 养过程中,能使再生不定芽频率产生差距的原因很多,其中 与叶片的叶龄,部位、大小等生理差异都有一定的关系。

3讨论 总之本次实验验证了外源NPT-Ⅱ基因在转基因菊花叶 片中能够表达,同时也验证了雪花莲凝集素基因能在转基因 菊花中得到表达,它们赋予了叶片在选择培养基上很强的再 生能力。本实验所用的转化材料是2年前进行基因转化所获 得的,至今试管苗已经经过了十几次继代培养,实验表明外 源基因在继代培养上基本是稳定的。注释: [1]蒋细旺,包满珠,吴家和,张献龙,田颖川.农杆菌介 导CryIAC基因转化菊花.园艺学报.2005,32(1):65-69 [2] 王关林,刘彦泓,郭绍华,王宇,纪彦,方宏筠.雪花莲 凝集素基因转基因菊花及转基因植株的抗蚜虫性研究.遗传 学报.2004,31(12):1434-1438 [3] 崔德才,徐培文.植物组织培养与工厂化育苗.北京. 化学工业出版社.2003.5:22-43,283 [4] 胡繁荣。丰香草莓叶片离体再生的试验研究.辽宁 农业职业技术学院学报.2001 [5] 郭勇,崔堂兵,谢秀祯.植物细胞培养技术与应用.北 京.化学工业出版社.2004.1:72