制首乌 [讨论基于肾阳虚证候研究制首乌对肝细胞的影响]

讨论基于肾阳虚证候研究制首乌对肝细胞的影响

材料 1. 细胞系及培养条件 人正常肝细胞株L02，购自湘雅中心实验室细胞库，在含10%胎牛血清的 RPMI-1640完全培养基，37℃，5%CO2及饱和湿度条件下进行常规培养，所有试 验均在细胞对数生长期进行。

2 . 药品与试剂 R PMI-16 4 0完全培养基、胎牛血清、胰蛋白酶，购自美国Gi b co公司;噻 唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)，购自美国Sigma公司;Annexin V-FITI/PI细胞凋 亡检测试剂盒，购自南京凯基生物科技发展有限公司，批号：20140630;何首乌 药材，购自四川成都荷花池药材市场，批号：1209341405。

3. 动物 SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，体质量(20020)g，3月龄，购自西安交通大 学实验动物中心，许可证号：SCXK(陕)2012-003，饲养于陕西中医药大学实验 动物中心。饲养环境保持室温20-25℃，相对湿度40%-60%，实验动物自由进食 和饮水。4. 仪器 Cell Lab流式细胞仪，美国贝克曼公司;AE-21倒置显微镜，麦克奥迪公 司;CB-150二氧化碳培养箱，德国Binder公司;DHG-9075 A型电热恒温鼓风干燥箱， 上海一恒科技有限公司;TGL-16G高速台式离心机，上海安亭科学仪器 厂;EX-8080酶标仪，美国BIO-TEK公司;TS100-F倒置荧光数码显微镜，日本Nikon 公司。

方法 1. 制首乌药材及水煎液的制备 将生何首乌按照2010年版《中华人民共和国药典》方法(清蒸法)进行炮制， 随后将制首乌分别按照高、中、低浓度进行煎煮。煎煮方法为：将制首乌置于煎 煮容器中，加入相当于药材量5倍的冷水浸泡60min，煮沸30min，再加入相当于 药材量3倍的冷水继续煎煮，20min后，煎煮液浓缩。

2. 制首乌含药血清的制备 SD大鼠40只，随机分为4组，每组10只。其中，3组大鼠皮下注射氢化考 的松，每日1次，25mg/kg，连续14d，造成肾阳虚证模型[9]，另1组为生理盐水 组。随后各组分别以高(43.2g/kg)、中(21.6g/kg)、低浓度(10.8g/kg)的制首乌水煎 液及0.9%氯化钠溶液灌胃，每天给药2次，连续7d，末次给药1h后乙醚麻醉大鼠， 无菌条件下心脏取血，立即注入无菌管里，室温静置，待血液凝固，血清析出后， 吸取上清液离心，3 000r/min，10min后再吸取上清液，即得制首乌含药血清。血 清混合后，置于56℃水浴中灭活30min，用0.22m微孔滤膜过滤除菌。经培养实验 证实无微生物污染后，置于-20℃冰箱中保存备用。

3. MTT法测定肝细胞线粒体功能 将细胞接种于培养瓶中，加入含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640完全培养 基5mL，置37℃、5%CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养，镜下观察细胞贴壁生长 情况。取生长状态良好的同一批传代细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化， 用10%FBS的RPME-1640培养液将细胞重悬，以每孔103-104个细胞接种于96孔培 养板中，每孔体积为100L，继续培养24h，使细胞同步化。各组分别加入高、中、 低浓度的制首乌含药血清及正常大鼠血清(终浓度为15%)，每组6个复孔，设只加 培养基的调零孔3个。置37℃、5%CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养24、48h。每孔加入MTT溶液(5g/L，用PBS配制，pH=7.4)10L。继续在37℃、5%CO2培养 箱内培养4h，小心地将每孔的培养液吸出，加入DMSO150L，在摇床上中速摇匀 10min。酶标仪490nm波长，检测各孔光吸收值(A)。

4. 流式细胞术(flow cytometry，FCM)测定 肝细胞凋亡率 取生长状态良好的同一批传代细胞，用0.25%胰蛋白酶消化 液消化，用含10%FBS的RPMI-1640培养液重悬，以2104/mL，每孔2mL接种于6 孔培养板中，继续培养24h，使细胞同步化。各组分别加入15%高、中、低浓度 的制首乌含药血清培养48h，生理盐水组以生理盐水组大鼠血清代替，更换新的 10%FBS+MEM培养液200L。细胞经处理到所需时间后，收集细胞，用预冷的PBS 洗3次后，应用AnnexinV-PI双标试剂盒，按照试剂盒说明书要求，采用FCM及荧 光显微镜分别检测和观察细胞凋亡情况。用流式细胞仪计数位于凋亡区内的细胞 数量得到凋亡细胞百分率。

5. Annexin V-FITC/PI双染色荧光显微镜观察 L02肝细胞凋亡状态 取生长状态良好的同一批传代细胞，用0.25%胰蛋白 酶消化液消化，用含10%FBS的RPMI-1640培养液重悬，接种于含盖玻片的6孔培 养板中，各组分别加入15%高、中、低浓度的__制首乌含药血清培养48h，生理 盐水组以生理盐水组大鼠血清代替。用PBS洗涤细胞2次，在50 0L的Binding Buffer中加入5L Annexin V-FITC，5LPropidium Iodide，混匀后滴加于盖玻片表面， 使盖玻片表面均匀覆盖。避光、室温反应5min。将盖玻片倒置于载玻片上，用荧 光显微镜、双色滤光片观察。

6. 统计学方法 数据统计采用SPSS 19.0软件进行分析，计量资料以x-s表示，单因素方差 分析(One-way ANOVA)比较多组间的差异性，以P0.05为差异有统计学意义。结 果1 . 制首乌含药血清对L 0 2肝细胞增殖的影响 见图1。与生理盐水组相比，15% 肾阳虚各浓度组含药血清作用24h及48h后，均对L02肝细胞增殖有一定的抑制作 用，其中，肾阳虚中、高浓度组含药血清作用48h后对L02肝细胞增殖的抑制率分 别为15.23%、24.92%，与生理盐水组比较，差异显著(P0.05，P0.01)。

2. 制首乌含药血清对L02肝细胞凋亡率的影响 收集经制首乌含药血清处理后的L02肝细胞，用Annexin V-PI双标试剂盒，进行AV/PI双染后用流式细胞仪检测L02肝细胞的凋亡率。结果判定标准：
Annexin V-/PI-为正常细胞，Annexin V+/PI-为早期凋亡细胞，Annexin V+/PI+为 晚期凋亡细胞或坏死细胞，Annexin V-/PI+为细胞膜机械损伤的细胞。实验结果 表明，各组均出现不同程度的细胞凋亡，凋亡细胞多为晚期凋亡细胞或坏死细胞。

与生理盐水组相比，肾阳虚各浓度组细胞凋亡率均出现明显升高，其中，肾阳虚 中、高浓度组细胞凋亡率与生理盐水组比较，差异显著(P0.01)。

3. 制首乌含药血清对L02肝细胞凋亡荧光染色的影响 双染后，正常细胞无荧光;细胞膜绿色荧光为早期凋亡细胞，细胞膜绿色 荧光而细胞核红色荧光为晚期凋亡细胞，红色荧光为坏死细胞。生理盐水组中凋 亡细胞较少，肾阳虚大鼠制首乌含药血清给药后，其中，肾阳虚中、高浓度组出 现早期凋亡及晚期凋亡的细胞较多。

讨论 中医传统理论认为，中药的毒性是其治疗作用的基础。《景岳全书类经》 云：药以治病，因毒为能，所谓毒者，因气味之有偏也⋯⋯所以去人之邪气。《黄 帝内经》中记载有有故无殒之说，明代医家张景岳解释道：大积大聚之故，有是 故而用是药，所谓有病则病受之⋯⋯非用毒药不能攻，攻亦无害，故可犯也。明 确提出了有病则病受之的观点，提示在认识中药时不应孤立地去研究药物本身， 而应该着眼于药物与机体的相互关系。当机体有邪气时，药物作用于病邪，表现 出的是治疗作用，而当药物作用于正常机体时，所谓偏性(毒性)就有可能作用于 机体本身，因此，本文在建立肾阳虚大鼠模型的基础上，来研究制首乌含药血清 对L02肝细胞的影响。

本课题采用对大鼠注射氢化考的松的方法，建立肾阳虚模型，造模后与生 理盐水组比较，肾阳虚各浓度组大鼠出现形体消瘦，体毛稀疏、脱毛，拱背，蜷 曲，肢尾冷、挤卧在一起，肛温降低等表现，符合中医阳虚证的临床表现[9]。

其后分别采用MTT法、流式细胞术及荧光染色观察肾阳虚证制首乌含药血清对 L02肝细胞增殖及凋亡状态的影响。MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法， 其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性 的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。DMSO能溶解细胞中的 甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数 量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。FCM是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选 的检测手段，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点， 成为当代最先进的细胞定量分析技术。细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，这 些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外，而 Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有高度的亲和性，可充当检测 PS的敏感探针。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中， 碘化丙啶(PI)则能透过凋亡中晚期的细胞核死细胞并使细胞核染红。因此，本文 采用Annexin V结合PI染料以检测区分不同凋亡时期的细胞。

本实验结果显示，15%肾阳虚各浓度组含药血清作用24h及48h后，均对L02 肝细胞增殖有一定的抑制作用，肾阳虚高浓度组含药血清作用48h后细胞抑制率 达24.92%。肾阳虚中、高浓度组的细胞凋亡率明显升高，分别为27.54%和30.75%。

Annexin V-FITC/PI荧光染色结果也显示，肾阳虚中、高浓度组出现早期凋亡及晚 期凋亡的细胞明显增多。实验结果显示，制首乌肾阳虚含药血清作用于肝细胞后， 肝细胞增殖的抑制率及肝细胞凋亡率均出现显著性增高，且呈剂量相关性，提示 肾阳虚证为制首乌致肝损伤的靶向证候。本研究为临床上正确使用制首乌，避免 不良反应的出现提供了依据，制首乌为传统的滋补肾阴的代表性药物，在临床应 用时应辨证施治，避免应用于肾阳虚证候药不对证的情况出现。