黄曲霉毒素怎么检测 讨论牛黄清心丸中黄曲霉毒素的检测

讨论牛黄清心丸中黄曲霉毒素的检测

以AFB1为例，其原理是使样品中的AFB1首先与胶体金颗粒表面的抗 AFB1单克隆抗体反应，如果样品中AFB1的含量超过限量值，胶体金的抗体位点 将不再有剩余，当胶体金颗粒层析经过检测线时，胶体金颗粒将不会停留在该线 的所在位置，继续上行时与质控线上喷涂的羊抗鼠IgG 反应，呈现出胶体金的红 色条带。如果样品中不含AFB1或AFB1含量低于限值，胶体金表面的抗体将与检 测线上的化合物反应呈现出红色条带，质控线也呈现红色条带。GICA 快速检测 黄曲霉毒素已在食品和中药材中广泛应用。该法使用简单方便，非常适合现场快 速检测黄曲霉毒素的残留量。本实验选用70% 甲醇溶液提取样品中的黄曲霉毒 素，采用GICA 法进行检测，通过图像分析定量检测样品中黄曲霉毒素的含量。

为了防止复杂基质的干扰，建议对GICA 法检出阳性结果的样品，再经过免疫亲 和柱- 高效液相色谱法( IAC - HPLC 法)进行分析确证。

1 材料与方法1. 1 仪器 Waters e2695 分析型高效液相色谱仪，包括Waters 2489 DAD 检测器( 美 国Waters 公司) ;
光化学衍生器( 美国AURA 公司，反应线圈15 m，灯管254 nm) 。Cloversil C18反相色谱柱( 4. 6 mm 150mm，5 IAC - SEP  黄曲霉毒素总 量免疫亲和柱;
iCheck  食品安全定量快检仪;
iCheck  总黄曲霉毒素定量快 检试剂盒( 产品号: CS101 - J;批号: AF08200801) : iCheck  黄曲霉毒素快检卡 ( 25 套) ，黄曲霉稀释缓冲液( 5 mL) 和黄曲霉快检二维码;
iCheck  AFB1定量 快检试剂盒( 产品号:CS103 - J;
批号: AF08200801) : iCheck  AFB1定量快检卡 ( 25 套) ，均购自北京中检维康技术有限公司。

1. 2 试剂 甲醇、乙腈( 美国Fisher 公司，色谱纯) ;
黄曲霉毒素混合标准品( 北京中 检维康技术有限公司) 。样品处理及溶液配制中使用的超纯水由Mini - Q 超纯水 处理系统制备( 美国Millipore 公司) 。实验中抽取测试样品的信息。

1. 3 溶液配制 1. 3. 1 混合对照溶液精密吸取黄曲霉毒素混合 标准品( 黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2标示质量浓度分别为1. 0、0. 3、1. 0 和0. 3 gmL - 1 ) 100 L 至10mL 量瓶中，用流动相定容至刻度，得到含黄曲霉毒 素B1和G1为10 ngmL - 1，黄曲霉毒素B2和G2为3 ngmL - 1的溶液，即得。

1. 3. 2 磷酸盐缓冲溶液称取氯化钠8. 0 g，磷酸 氢二钠1. 44 g，磷酸二氢钾0. 24 g，氯化钾0. 2 g，用纯水990 mL 溶解， 然后用浓盐酸调节pH 至7. 0，再纯水稀释至1 000 mL，即得。

1. 3. 3 吐温/磷酸盐缓冲溶液将吐温- 201. 0 mL加入到1. 3. 2项下配制的磷 酸盐缓冲溶液中，混匀制成0. 1%的吐温/磷酸盐缓冲溶液。

1. 3. 4 供试品溶液水丸用研钵粉碎，蜜丸剪碎成小块，称取粉碎或小块样 品5. 0 g 于50 mL 离心管，待用。在上述称有样品的50 mL 离心管中加入70%甲 醇溶液25. 0 mL，剧烈振荡3 min 至完全溶解，用定性滤纸过滤，即得GICA 法 用供试品溶液。在上述称有样品的50 mL 离心管中加入氯化钠1. 0 g，加入70%甲醇溶液25. 0 mL，高速搅拌2 min，量取上清液10 mL 置于20 mL 量瓶中，用 水稀释至刻度，用0. 45 m 滤膜过滤，即得IAC -HPLC 法用供试品溶液。

1. 4 检测方法 1. 4. 1 GICA 法从iCheck  总黄曲霉毒素定量快检试剂盒或iCheck  AFB1定量快检试剂盒中取出 相应定量快检卡和黄曲霉毒素稀释缓冲液，平衡至室温。将iCheck  食品安全定 量快检仪自带的零点校正片插入定量快检仪测定室，进行零点校正 将相应批次 的快检卡二维码输入到iCheck  食品安全定量快检仪中，获取校准曲线。将定量 快检卡外包装打开，取出相应微孔固定于微孔架上，快检卡放置于37 ℃ 恒温器 上。取黄曲霉毒素稀释缓冲液120 L 于相应微孔中，加入1. 3. 4项下配制的GICA 法用供试品溶液30 L，用移液器吸打5 次混匀，取100 L 加入到快检卡样品孔中。

37 ℃反应10 min 后，立即将快检卡放入定量快检仪中，点击检测分析读数，即 为样品实际浓度。

1. 4. 2 IAC - HPLC 法使用 1. 3. 3项下配制的吐温/磷酸盐缓冲溶液将免疫亲和柱上杂质除去，精密量 取1. 3. 4项下配制的IAC - HPLC 法用供试品溶液25 mL，以流速2 mLmin - 1 通 过免疫亲合柱，用5 mL 蒸馏水洗脱，并用空气压出柱中残留蒸馏水，用1. 5 mL 甲醇洗脱，甲醇洗脱液置2 mL 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀待HPLC 检测。

色谱条件:采用Cloversil C18色谱柱( 5 m， 4. 6 mm 150 mm) ，以甲醇- 水( 45∶ 55) 为流动相，流速0. 8 mLmin - 1，检测器为荧光检测器，激发波长ex = 360 nm， 发射波长em =440 nm，进样量20 L，光化学衍生化系统为光化学衍生器。使用上 述IAC - HPLC 方法，对供试品溶液进行测定。

2 结果与讨论 2. 1 GICA 方法学验证 抽取3 个批次不同剂型不同标准的样品进行方法学验证: 分别从1、4 和9 号厂家随机抽1 批次样品，编号为A、B 和C，其中C 为水丸。将A、B 和C 3 个批次样品按1. 3. 4项下配制方法制成GICA 法用供试品溶液。使用标准加入法， 在供试品溶液中加入黄曲霉毒素标准品至终浓度分别为0、3. 125、6. 25、12. 5、 25. 0 gkg - 1。按1. 4. 1项下GICA方法进行检测，每批次样品平行重复3 次，结果见表2。A、C 无黄曲霉毒素检出，而B 中黄曲霉毒素总量和AFB1均检出( 最低 检出限3 gkg - 1 ) 。A 和C回收率在73. 0% ～ 105. 0% 之间，符合关于痕量分 析回收率要求范围( 70% ～ 110%) [11]。B 样品回收率为44. 6% ～ 92. 2%，部 分低于60%，说明样品基质干扰较大，不适合用GICA 法检测。

2. 2 IAC - HPLC 法验证 按照1. 3. 4项下方法制备IAC - HPLC 法用供试品溶液，按1. 4. 2项IAC - HPLC 条件测定A、B 和C 3 批次样品中黄曲霉毒素的含量。黄曲霉毒素B1、 B2、G1和G2的最低检出限分别为0. 2、0. 1、0. 3 和0. 3 gkg - 1。使用IAC - HPLC 法对3 批次样品进行检测，所有结果均小于黄曲霉毒素的最低检出限( 表3) 。

与表2 结果进行比对可知，使用GICA法检测B 样品的加入回收率较低，且本底 有黄曲霉毒素检出，而使用IAC - HPLC 法验证时并未检出黄曲霉毒素，推断 GICA 法在检测B 样品时可能存在假阳性结果。在A 和C 样品检测时， IAC -HPLC 方法和GICA 方法均未检出黄曲霉毒素，结果表明在现有分析条件下， 未发现假阳性。

2. 3 实验结果 2. 3. 1 GICA 检测结果 使用GICA 方法分析38 批次样品。实验首先选用黄曲霉毒素总量试剂盒 进行，若有总黄曲霉毒素检出( 检出限gkg -1 ) ，则使用AFB1试剂盒对检测结果 进行分析整理，见表4。所有厂家黄曲霉毒素限量均符合中国药典2010 年版一部 规定，合格率为100%。其中，3个厂家的5 批次样品总黄曲霉毒素和AFB1均有 检出，检出率为13. 16%。

2. 3. 2 IAC - HPLC 验证结果 为了验证GICA 法的准确性，实验中选择了厂家提供的六神曲( 炒) 对照 药材和成药共9 份样品进行IAC - HPLC 检测。六神曲( 炒) 药材2 批次:Ⅰ为5 号厂家，Ⅱ为10 号厂家;
AFB1检出的大蜜丸5 批次:Ⅲ为1 号厂家，Ⅳ和Ⅴ为4 号厂家2 个批次，Ⅵ和Ⅶ为10 号厂家2 个批次;
随机选取未检出黄曲霉毒素的 样品2 批次作为阴性对照: Ⅷ为1 号厂家，Ⅸ为6 号厂家。检测结果见表5。由IAC - HPLC 法检测结果可知，六神曲( 炒)药材( Ⅰ和Ⅱ) 均有黄曲霉毒素检出，其 中Ⅰ中AFB1含量为0. 6 gkg - 1，而对应的5 号厂家的成药中未检出黄曲霉毒素( GICA 法检出限3. 0 gkg -1 ) 。10 号厂家提供的六神曲( 炒) 药材( Ⅱ) 和成药 ( Ⅵ和Ⅶ) 均有黄曲霉毒素检出: Ⅱ中AFB1为2. 1gkg - 1，AFB2为0. 3 gkg - 1 ;
Ⅵ中AFB1为1. 3gkg - 1 ;
值得注意的是，Ⅶ样品的黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2 均有检出，见表5。样品Ⅲ、Ⅵ和V 用GICA 法均有黄曲霉毒素检出，但使用IAC - HPLC法检测并未检出，这与方法学验证中4 号厂家样品的验证结果一致，应 为假阳性结果。

3 结论 牛黄清心丸( 局方) 有29 味药材组成，成分复杂，基质干扰较大。由验 证实验可以看出，GICA 法可以用于牛黄清心丸( 局方) 中黄曲霉毒素的检测。

在验证实验中，A、C 2 个样品的加标回收率符合痕量检测要求，而B 样品蜜丸 发硬现象明显，可能是由于炼蜜的质量较差，从而导致B 样品基质影响较大， 有假阳性结果，须再经过IAC - HPLC 法验证。对38 批次抽样的牛黄清心丸( 局 方) 样品进行检测，有5 批次有黄曲霉毒素检出，检出率为13. 2%，且均为蜜丸。

在前期处理剪碎蜜丸时，这5批蜜丸性状与其他样品有一定区别，譬如蜜丸手感 比较粗糙无细腻滋润感，硬度偏硬，其中4 号和10号厂家的蜡丸表面有明显裂纹。

由实验结果可知，蜜丸制作工艺直接影响GICA 法的结果，但对IAC - HPLC 法 影响不大。所以在对复杂样品的检测中，建议可用GICA 法和IAC - HPLC 法2 种 方法结合验证，从而保证检测结果的准确性。