调节性T细胞 CD4+,CD25+,Foxp3+及CD4+,CD25-,Foxp3+调节性T细胞在小鼠衰

CD4+ CD25+ Foxp3+及CD4+ CD25- Foxp3+调节性T细胞在小鼠衰

Www.133229.cOM 【关键词】 cd4+ cd25+ foxp3+ t细胞 cd4+ cd25- foxp3+ t细胞 衰老 小鼠 gao qi, ma tian, zhang xia, jiang yang, zhang li  ning (institute of immunology, school of medicine, shandong university, jinan 250012, china) to explore the relationship between t cells and aging. methods 15 mice were divided into three groups: the 2  month (young), the 6  month (middle  aged) and the 15  month (aged) groups. splenocyte suspensions were prepared in sterile conditions. surface marks were stained with the pecy5  conjugated cd4 antibody and the fitc  conjugated cd25 antibody. after being washed with pbs, cells were treated with stiletto fluid and fixation fluid and stained with the pe  conjugated foxp3 antibody. the proportion of cd4+ regulatory t cells was analyzed by flow cytometry. results the proportion of cd4+ t cells and cd4+ cd25+ /cd4+ t cells in splenocytes had no significant differences among the three groups. but the proportion of cd4+ foxp3+ t cells was significantly elevated with an increase of age. the proportion of cd4+ foxp3+ t cells was(16.83±0.44)% in aged mice, which was obviously higher than young and middle  aged mice（p＜0.01）, and the proportion of cd25+ foxp3+ regulatory t cells gradually decreased. the proportion of cd25+ foxp3+ t cells in theaged group or in middle  aged mice was lower than that in young mice（p＜0.05）. however, the proportion of cd25- foxp3+ regulatory t cells continuously elevated with an increase of age. its proportion in aged mice was significantly higher than that in middle  aged mice(p＜0.01), and that in middle  aged mice was higher than that in young mice(p＜0.01). in addition, the ratio of cd4+ cd25+ foxp3+ t to cd4+ cd25- foxp3+ t cells showed a decreasing tendency with an increase of age. conclusion the proportion of cd4+ cd25+ foxp3+ t cells shows an decreasing tendency with an increase of age, however, the proportion of cd4+ cd25- foxp3+ t cells shows an increasing tendency. these suggest that the two regulatory subsets play different roles in aging. key words：
cd4+ cd25+ foxp3+ t cell ;
cd4+ cd25- foxp3+ t cell;
aging;
flow cytometry 调节性t细胞（regulatory t cell, treg）是能抑制其他免疫细胞活化、增 殖的一群细胞，在维持自身内环境的稳定、防止自身免疫性疾病的发生、抑制移 植排斥反应等疾病中发挥重要的保护作用。目前对其特性了解最多的是cd4+ cd25+ foxp3+调节性t细胞，它们数量和功能的降低与移植排斥反应和多种自身免 疫性疾病的发生有关，其数量的升高成为肿瘤免疫耐受的重要机制，然而，对于 cd4+ cd25+ foxp3+调节性t细胞与衰老的关系的报道较少。另外，机体内尚有cd4+ cd25- foxp3+调节性t细胞的存在，它们与疾病的关系，特别是与衰老的关系尚不 清楚。本研究分析cd4+ cd25+ foxp3+ 和cd4+ cd25- foxp3+两群调节性t细胞在不 同鼠龄小鼠的变化规律，为研究不同调节性t细胞亚群与衰老的关系提供试验依 据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 动物 15只健康雄性c57bl/6小鼠购于山东大学实验动物中心，其 中鼠龄2个月（青年）、6个月（中年）和15个月小鼠（老年）各5只，均在清洁 级环境下喂养。

1.1.2 试剂 pecy5标记的抗小鼠cd4（pecy5  cd4）抗体、fitc 标记的 抗小鼠cd25（fitc  cd25）抗体购于bd bioscience公司，pe标记的抗小鼠foxp3 （pe  foxp3）抗体、核内染色用打孔液和固定液均购于ebioscience公司， mccoy′s 5a培养基购于sigma公司，胎牛血清购于上海微科生化试剂有限公司。

1.2 方法1.2.1 小鼠脾细胞悬液的制备 取不同鼠龄c57bl/6小鼠脾脏，用200目 铜网研磨制备单个脾细胞悬液，离心弃上清后pbs洗1遍，然后加入5ml红细胞裂 解液室温作用5min，pbs调整细胞浓度为1×107/ml。

1.2.2 流式细胞染色及检测 取1×106个脾细胞，分别加入pecy5  cd4、 fitc  cd25抗体，4℃下避光孵育30min，进行表面染色；
pbs洗涤2次，加入1ml 打孔液，混匀，4℃下避光作用2h；
用2ml固定液洗涤细胞2次并固定细胞，然后 加入pe  foxp3抗体，混匀，4℃下避光孵育30min，进行核内染色；
用固定液洗 涤细胞2次，最后加600μl pbs（含0.1%bsa）重悬细胞，用beckman cytomics(tm) fc 500流式细胞仪进行检测。

1.2.3 统计学处理 所有数据用spss 11.5统计学软件进行分析。计量数 据以±s表示，各项指标比较采用t检验，p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 小鼠脾细胞中cd4+ foxp3+ t细胞的数量变化 见图1a、b和图2a、b。

由图1a、b可见，流式细胞术的检测结果显示，2个月、6个月和15个月小鼠脾脏 中cd4+ t细胞的数量差异无统计学意义（2个月：26.58±0.89；

6个月：24.12±0.50；

15个月：27.3±0.30；
p＞0.05），3组间cd4+ cd25+ t/cd4+ t细胞数量也无明显改变 （2个月：8.28±0.06；
6个月：7.05±0.55；
15个月：7.67±0.27；
p＞0.05）。由 a：
facs analysis of splenocytes for the proportion of cd4+ and cd4+ cd25+ t cells；

b：
statistic results of the proportion of cd4+ and cd4+ cd25+ t cells图2a、b可见，随小鼠 年龄的增加cd4+ foxp3+ t/cd4+ t的数量明显升高，15个月小鼠cd4+ foxp3+ t/cd4+ t 的数量较2个月和6个月小鼠明显升高（2个月：16.83±0.44；
6个月：11.5±0.25；

15个月：12.30±0.64；
p＜0.01）。

图2 cd4+ 调节性t细胞在不同年龄小鼠脾细胞 中的数量 2.2 小鼠脾细胞中cd4+ cd25+ foxp3+ t细胞的数量随年龄增加而降低 见图2a、c。进一步分析cd4+ foxp3+ t细胞中cd4+ cd25+ foxp3+ t细胞的数量发现， 6个月小鼠脾细胞中cd4+ cd25+ foxp3+ t细胞数量较2个月小鼠明显降低［(6个 月：(5.92±0.47)%；
2个月：(7.70±0.07)%；
p＜0.05)］，15个月小鼠与6个月小鼠 相比较差异无统计学意义（p＞0.05）；
上述结果说明随小鼠年龄的增长，cd4+ cd25+ foxp3+ t/cd4+ t细胞的数量明显降低。2.3 cd4+ cd25- foxp3+ t细胞的数量随年龄增加明显升高 见图2a、d。

cd4+ t细胞中存在一群cd25- foxp3+ t细胞，这群细胞在小鼠2个月龄时数量为 （3.65±0.19）%，6个月为（6.32±0.57）%，后者较前者明显升高（p＜0.01）；

15个月小鼠cd25- foxp3+ t细胞的数量进一步升高，达到（11.0±1.37）%，与6个 月小鼠相比较明显升高（p＜0.01）。以上结果说明，数量升高的cd4+ foxp3+ t 细胞中主要是cd25- foxp3+ t的细胞，随着年龄的增长cd4+ cd25- foxp3+ t/cd4+ t 细胞的数量呈上升趋势。

2.4 cd4+ cd25+ foxp3+ t细胞与cd4+ cd25- foxp3+ t细胞的比值下降 见图3。根据上述结果可以看出，小鼠脾细胞中存在两群cd4+ 调节性t细胞，cd4+ cd25+ foxp3+ t细胞的数量随年龄增加而降低，cd4+ cd25- foxp3+ t的数量随年龄 增加明显升高，计算这两个细胞亚群的比值结果显示呈现下降的趋势（2个月：
1.97±0.07 ；
6个月：0.94±0.10；
15个月：0.73±0.06；
p＜0.001），6个月和15个 月小鼠较2个月小鼠明显降低。

3 讨 论 调节性t细胞是一群能抑制免疫功能的负调控细胞，其中cd4+ cd25+ 调节性t细胞，cd4+ cd25+ t细胞在小鼠中占外周cd4+ t细胞的数量大约为5%～ 10%，是一种具有抑制作用的t细胞［1］。cd4+ cd25+ t细胞主要从胸腺发育分化 形成，foxp3 (forkhead/winged helix transcription factor 3 ，foxp3) 称*状头/翅膀状 螺旋转录因子，在调控treg细胞的发育上起重要的作用。有资料显示，用载体向 天然的cd4+ t细胞导入foxp3可以实现cd4+ t细胞向cd4+ cd25+ t细胞的转化，而缺 乏foxp3的cd4+ cd25+ t细胞没有抑制功能［2］。fontenot等用foxp3突变小鼠发现 了cd4+cd25+调节性t细胞发育缺陷而cd4+ cd25- t细胞则不受影响，异位表达 foxp3的细胞对cd4+ cd25- t细胞具有抑制作用，以上均说明foxp3是cd4+ cd25+ t 细胞发育和功能维持的重要调节因子［2  3］。分段目前认为cd4+ t细胞随年龄 的增长其对抗原的应答能力减弱［4］。小鼠老化会伴随胸腺微环境发生很大的 变化，主要表现为胸腺的退化，研究认为胸腺退化是t细胞功能减弱的主要原因 ［4  6］，其后果可能会导致感染性疾病的发病率升高。胸腺是cd4+ cd25+ t细 胞产生的中心，随着小鼠年龄的增长胸腺退化可能会导致cd4+ cd25+ t细胞产生 减少，从而使cd4+ cd25+ foxp3+ t细胞的数量在年老小鼠外周免疫器官中降低。

本研究区分了表达foxp3的细胞亚群，结果显示cd4+ t细胞群体中，cd4+ cd25+ foxp3+ t细胞到了小鼠6个月的时候数量明显减少，6个月之前这群细胞变化不很 明显；
另外还存在一群cd4+ cd25- foxp3+ t细胞，它们的数量随着年龄的增长呈现明显上升的趋势：年老小鼠体内出现了相当数量的cd25- foxp3+ t细胞，而cd4+ cd25+ foxp3+ t细胞反而降低。cd4+ cd25- foxp3+ t细胞与cd4+ cd25+ foxp3+ t细胞 功能上的差别尚不清楚。cd4+ cd25- foxp3+ t细胞的发现提示，小鼠老化后其免 疫功能的改变是否与cd4+ cd25- foxp3+ t细胞有关？这群cd25-调节性t细胞是否 也具有抑制效应性t细胞的功能？这为进一步研究老化所导致的免疫功能低下提 供了新的思路。