僵蚕七种化学成分抗肿瘤活性的初步研究
僵蚕七种化学成分抗肿瘤活性的初步研究 肿瘤是继人类心脑血管疾病之后的第二大疾 的重要课题.从药用动 植物中挖掘抗肿瘤活性成分 病.寻找有效的抗肿瘤药物和方法是世界医学面临 是当今肿瘤药物研究和开发的重要途径之一，而且其有效性优势越来越明显，紫 杉醇、喜树碱和长春 碱等从药用植物中发掘的抗肿瘤活性化合物已经开 发成广 谱性的抗肿瘤药物并被广泛推广
应用.僵蚕 (Bombyx batryticatus)为蚕蛾科昆虫 家蚕幼虫期感 染白僵菌（Beauveria bassiana)而致死的干燥全 虫，含有蛋白质、 脂肪酸、氨基酸、草酸铵、白僵 菌素以及微量元素等成分12 .传统中医理论认为 僵蚕具熄风止痉、活血通络和化痰散结等功效，而 现代药理学研究发现僵蚕提 取物具有抗凝、抗血 栓、抗惊厥、降糖和降脂等作用卜5]，目前多用于 治疗癫 痈、顽固性头痛等疾病[6 7].僵蚕也常作为 脑血栓、脑栓塞、脑梗塞、脑中风和 脑出血后遗症 等治疗药物的原料.近年来有研究证实僵蚕对癌症 具有一定治疗 作用[8],有研究者从僵蚕内分离和 鉴定出麦角甾醇、棕榈酸、赤藓醇、(5 -豆甾 醇、 甘露醇、胡萝卜苷和尿嘧啶等7种化学成分，其中 前6种为首次从僵蚕中分 离得到M，而这7种僵蚕 来源的化学成分的药物性质和药理作用在国内外鲜 有 报道，本试验以B16~F10小鼠黑色素瘤细胞和 A375人黑色素瘤细胞为模型，针 对僵蚕内证实存 在麦角甾醇、棕榈酸、赤藓醇、p -豆甾醇、甘露 醇、胡萝卜苷 和尿嘧啶等7种物质的抗肿瘤活性进 行初步研究，希望能够为其抗肿瘤机理的研 究奠定 理论基础. 1材料与方法 1.1材料麦角甾醇、棕榈酸、赤藓醇、p -豆甾醇、甘 露醇、胡萝卜苷和尿 嘧啶，纯度均在质量分数 90%以上，购自SIGMA公司；
B16~F10小鼠黑色 素瘤 细胞和A375人黑色素瘤细胞购自美国模式菌种收集中心(American Type Culture Collection， ATCC) ;
3 - (4,5- 二甲基_唑-2) -2,5- 二苯 基四氮唑溴盐（MTT)、 二甲亚砜（Dimethyl sul¬foxide ,DMSO)购自SIGMA公司；
DMEM培养基 (Dulbecco"s modified eagle medium)、牛胎血清，购 自英杰生物技术公司. 1.2方法 1.2. 1细胞培养把B16~F10小鼠黑色素瘤细胞 和A375人黑色素瘤细胞接 种于含体积分数10%胎 牛血清的DMEM培养基中，5%CO2, 37 °C,饱和 湿度下常规培养.供试化合物用DMSO溶解成1 mol/L储存液-20 C保存，使用前用培养基 稀释 成所需浓度. 1.2.2MTT细胞活力检测取对数生长期的B16- F10和A375细胞，PBS 洗涤，胰蛋白酶消化，用 培养基稀释并调细胞密度到8 x 104〜1 x 105 个/mL, 以每孔100斗接种于96孔板中，实验设 空白调零组（只加等体积的培养液）和用 麦角甾 醇、棕榈酸、赤藓醇、p -豆甾醇、甘露醇、胡萝 卜苷和尿嘧啶处理组， 试样处理组分6个不同浓度 梯度，分别为 1.0、0.5、0.25、0.13、0.065 和 0 mmol/L. 每处理设6个重复，在常规培养条件下 培养72 h后，每孔加入质量浓度为5 mg/L 的MTT 10 mL,再培养4 h,然后弃掉培养液，每孔加入 150 ^L DMSO,室温下避光 低速振荡15 min,使结 晶物充分融解.选择570 nm波长，酶联免疫检测 仪 （Bio~RAD公司）测定各孔光密度值仏7。_,记录结果， D570nm = D570nm实验 组-D570nm调零组•以药物处理浓度对光密度值Dm nm绘制细胞活力变化曲线， 与对照处理组相比，如曲线变化趋势随加药浓度增 加明显下降，则对应药物对 细胞活力具有明显抑制 作用. 1.2.3数据处理利用Microsoft Excel软件对数 据进行统计分析，制作曲 线图. 2结果 2. 1麦角甾醇的抗肿瘤活性分别用不同浓度的麦角甾醇（0.065、0.13、0. 25、 0.5 和 1. 0 mmol/L)处理 B16-F10 小鼠黑色 素瘤细胞和A375人黑色素瘤细胞， 麦角甾醇能够 不同程度地抑制该两种细胞的生长，并呈现出明显 的浓度依赖性， 其中在0.13 mmol/L以上的处理浓 度抑制作用更明显（图1) 2.2p -谷甾醇的抗肿瘤活性分别以不同浓度的P -谷甾醇（0.065、0.13、0. 25、 0.5 和 1. 0 mmol/L)处理 B16~F10 小鼠黑色 素瘤细胞和A375人黑色素瘤细胞， [3 -谷甾醇能 够不同程度地抑制两种细胞的生长，并呈现出明显 的浓度依赖性， 其中0. 13 mmol/L以上的处理浓度 抑制作用更明显，而且高浓度的(3 -谷甾醇 （0.25 mmol/L以上）对B16~F10细胞的抑制作用明显高 于A375细胞(图2).2.3 棕榈酸的抗肿瘤活性经不同浓度的棕榈酸（0.065、0.13、0.25、 0. 5和1. 0 mmol/L)处理B16-F10小鼠黑色素瘤细 胞和A375人黑色素瘤细胞，发现 棕榈酸可不同程 度地抑制两种细胞的生长，并呈现出明显的浓度 依赖性，其中 0.25 mmol/L以上的处理浓度抑制 作用更明显，而且0. 25 mmol/L以上的浓度对 B16-F10细胞的抑制作用明显高于A375细胞 (图 3). 2. 4赤藓醇的抗肿瘤活性不同浓度的赤藓醇（0.065、0.13、0.25、0.5 和 1. 0 mmol/L)对B16-F10小鼠黑色素瘤细胞的 生长没有显著抑制作用，而高浓度 的赤藓醇（1.0 mmol/L)对A375人黑色素瘤细胞具有一定的促生 长作用（图4). 2.5 甘露醇的抗肿瘤活性不同浓度的甘露醇（0.065、0.13、0.25、0.5 和1. 0 mmol/L)对B16-F10小鼠黑色素瘤细胞的 生长无明显抑制作用，而同样浓 度甘露醇对A375 人黑色素瘤细胞表现出一定的促生长作用，但未呈 现浓度依 赖性（图5). 2.6 胡萝卜苷的抗肿瘤活性不同浓度的胡萝卜苷（0.065、0.13、0.25、 0. 5和1. 0 mmol/L)对B16~F10小鼠黑色素瘤细胞 的生长无明显抑制作用，而同样 浓度的胡萝卜苷对 A375人黑色素瘤细胞表现出一定的促生长作用， 但未呈现 浓度依赖性（图6). 2.7 尿嘧啶的抗肿瘤活性以不同浓度的尿嘧啶（0.065、0.13、0.25、 0. 5和1. 0 mmol/L)处理B16~F10小鼠黑色素瘤细 胞和A375人黑色素瘤细胞，两 种肿瘤细胞的生长Daucosterol on tumor cell growth 3讨论 僵蚕作为一种重要的传统中药，有关其药理作 用的研究已有不少报道， 主要集中在抗凝血、抗血 栓、降糖和降脂肪方面的研究M•僵蚕通过抑制 凝血 酶活性，激活纤溶酶，促进血中纤维蛋白原降 解，降低血浆及全血黏度，抑制 血液凝固和血栓形 成^],并且对士的宁所引起的小鼠惊厥以及抑制 癫痫发作有效[8] •僵蚕组分抗肿瘤方面的研究不 多，但僵蚕提取物对小鼠艾氏腹水瘤细胞 ECA有 明显的抑制作用，而且体外试验可抑制人体肝癌细 胞的呼吸作用[12] • 僵蚕蛹50%煎剂每日给小鼠灌 胃，对小鼠肉瘤细胞S180也有抑制作用 •本试 验 以B16~F10小鼠黑素瘤细胞和A375人黑色素瘤 细胞为模型，对僵蚕内的证实存 在的麦角甾醇、2 -谷甾醇、棕榈酸、赤藓醇、甘露醇、胡萝卜苷 和尿嘧啶等7 种化合物的抗肿瘤活性研究进行初步 研究，结果表明前3种化合物的抗肿瘤活性 明显， 而后4种化合物对2种肿瘤细胞的抑制作用不明 显.麦角甾醇、、S -谷甾 醇是甾体类化合物，大量 研究表明麦角甾醇和p-谷甾醇具有显著的抗肿瘤 活性. 酵母中提取的麦角甾醇对乳腺癌细胞有较强 的抑制作用[13],巴西菇中提取的麦 角甾醇能显著 抑制胃癌、肝癌细胞生长[14] • p -谷甾醇能够通过 抑制肿瘤细胞 增殖而抑制结肠癌、乳房癌、肺癌、 前列腺癌和肝癌细胞等的发生或发展[1519] •然而 有关麦角甾醇、p -谷甾醇以及其他植物甾醇抗黑 素瘤细胞的研究未见报 道.本试验证明两种甾醇均 具有抗黑素瘤活性，另一方面两者是僵蚕的重要化 学组分，在僵蚕的抗肿瘤活性中起着重要作用.棕0 0.065 0.130 0.250 0.500 1.000 尿P密卩定 Uracil/(mmol/L) 榈酸是动植物广泛存在的高级饱和脂肪酸，主要用 于日用化工、食 品等领域，如棕榈酸与维生素C 酯化合成的维生素C棕榈酸酯具有强烈的抗氧化 活性，被广泛用作营养强化剂和药物辅助剂[2°] • 环胞苷和棕榈酸酯化形成具有 抗癌活性的复合物环 胞苷二棕榈酸酯[21],然而有关棕榈酸单体的药理 药用研 究未见报道.本试验首次证实棕榈酸具有抗 肿瘤活性，既为棕榈酸的药用研究提 供了新思路， 也证实棕榈酸在僵蚕抗肿瘤活性中发挥着作用.综 合分析表明麦 角甾醇、p -谷甾醇、棕榈酸作为僵 蚕的化学组分在其抗肿瘤活性中起着重要作 用，本 试验对弄清僵蚕的抗肿瘤作用成分及其作用机理具 有一定意义
