染色体遗传学_灯刷染色体的研究进展及其在遗传学教学中的思

灯刷染色体的研究进展及其在遗传学教学中的思

不过，关于遗传学发展史上经典案例的研究和关注并不平衡。例如在 细胞遗传学三大经典染色体的研究中，关于唾腺染色体和巴氏小体的研究很多， 而灯刷染色体(Lampbrushchromosomes,L$Cs)的关注度较低。尽管LBCs因拥有数 以万计的芷在转录的单位而具有了结构的巨大性，但在过去曲130多年中公开发 表的文献仅有350多篇。究其原因可能有4点：
一是分离LBCs技术难度较大；
二是所使用的仪器是显微镜，而不是 时髦的微量移液器，导致学生的兴趣不足；
三是可用分离该染色体的典型材料不 易取得，多数动物材料都是各国重点保护的动物；
四是可能由于偏重理论研究， 无法取得足够的经费支持。尽管如此，LBCs的研究仍然取得了令人兴奋的成绩， 本文拟沿着LBCs研究的踪迹，比较系统地综述相关生物卵细胞减数分裂第一次 分裂双线期染色体的结构、组织形式以及转录等相关知识。最后将这一被忽视的 “明星染色体”案例介绍给学生，以期引导学生对LBCs研究的重视，激发他们学 习和研究遗传学的热情。

1灯刷染色体的研究进展 1882年，Flemming首先在蛛頓Wn"cfesceAW)的卵母细胞中发现了这 种结构,10年之后，Riickert(1892)在狗藍卵母细胞中再次发现了Flemming所描述 的结构，因为其形如19世纪的灯刷或20世纪的试管刷而命名为灯刷染色体典型的 LBCs实质上是存在于除哺乳动物以外几乎所有动物(在两栖类、鸟类和昆虫类都 有很好的研究)雌配子减数分裂第一次分裂双线期的一种暂时性巨大转录体,大小 可以达到5~6mm。细胞核中每个LBCs是二价体(一对同源染色体)，核中有几个二 价体就有几个LBCs，每个二价体包含四条染色单体，同源染色体通过交叉(Chiasmata)相连。它们具有独特的染色粒一侧环(Chromomere-lateralloop)结构：
染色粒串联形成单体的主轴，是遗传惰性区；
显著的侧环结构则为转录活性区， 包括了成千上万的活性转录单元。随着转录的进展，RNA链不断延长，外形呈“圣 诞树”样结构。除了在以上动物的卵细胞中发现LBCs夕卜，在果蝇精子细胞Y染 色体和植物中也有发现，比如在单细胞藻类中发现有典型的LBCs结构其它所报 道的植物LBCs不具有典型结构，只是一条较长的染色体，周围有绒毛状的结构。

由于LBCs在普通光学显微镜下可以看到，因而它是研究基因组结构和功能的极 为理想的实验材料。

1.1灯刷染色体的基本结构和细胞图 在普通光学显微镜下，在外观上看每一个典型的LBCs两个同源染色 体依靠几个交叉相连，它们分别由无数致密的染色质颗粒或染色粒串成线状，这 些颗粒之间有染色质丝相连，在每一颗粒或染色粒处产生1至数个成对的侧环， 这就构成了所谓LBCs上的“刷毛”这些环之所以成对出现是由于姐妹染色单体之 间没有任何联系造成的。利用扫描电镜或电镜技术结合免疫技术对来自不同物种 的LBCs进行观察，发现侧环是以纤细的染色质为轴，上面覆盖了无数的核糖核 蛋白(Ribonucleoprotein,RNP)颗粒。由于RNP颗粒相互聚集和沿侧环轴向的卷曲 会将正常状态的侧环一步一步装配形成小颗粒、颗粒球和紧密块状物等更高级的 侧环结构,因而形成了光学显微镜下可见的巨大染色体。

染色粒和连接它们的染色质丝构成了LBCs的轴，轴上最显著的特点 就是染色粒-侧环结构，某些有明显特征的侧环往往成为鉴定染色体特异性的界 标(Landmark),比如在两栖类中，几乎大部分灯刷染色体都有巨大的侧环，只是位 置不同，所以可以区分不同的染色体；
另一类是有特异结构的侧环，分为高密度 侧环和块状侧环，也存在于很多染色体不同位置中。轴上除了染色粒和侧环外， 还有着丝粒、端粒、球体等结构。这些结构常常出现在特定染色体的固定部位， 成为鉴别各条染色体的界标。染色粒(Chromomere)是LBCs轴的主要成分。在配 对的同源染色体中，染色体轴上染色粒的数目和分布大体相同，但形状不很规则。

在最初形成的LBCs上，单体灯刷染色体染色粒的数目可以达到5000个以上，在 光镜下染色粒大小从不可见到可见的1pm。据估算，一个有尾目的两栖动物LBCs 的染色粒所包含的碱基数目约5~10Mb,而侧环中仅有50-150kb的DNA[1"染色粒 的数目和大小与物种和减数分裂的推进有关，也随侧环转录活性而变化。随着减 数分裂的推进，染色粒逐渐变大，数目减少。在早期的LBCs中侧环转录活性髙， 这时染色粒小，数目多；
随着双线期的推进，侧环因转录活性下降而回缩，染色粒彼此融合最终成一条正常的分裂期染色体。侧环(Lateralloop)是DNA活跃转录 的区域，仅占整个LBCsDNA总量的0.2%~0.4%,其与染色粒的边界序列有无特异 性现在尚不清楚。在两栖类中，它们的长度与C值呈正相关，平均长度为1015llm, 长的可达200~300这些长的侧环具有染色体的特异性。多数侧环上只有一个转录 单位，转录方向可以相同或相反，利用转录抑制子的研究发现，这些转录多数由 RNApolII启动。侧环的产生并不同步，某些侧环能贯穿LBCs整个发育期；
有些 仅在个别时期产生，失去转录活性后回缩到染色粒中。激素处理也能影响侧环的 伸展和回缩，这点与果绳的唾腺染色体的蓬突结构类似，其发生机制和意义有待 进一步的研究。由于转录产物的种类、数量和堆积状态不同，在某些染色体轴的 特定部位可以形成不同类型的侧环，这成为区分不同LBCs的重要界标。LBCs的 着丝粒(Centromere)有二种形态：一种是在某些两栖类中称为着丝粒颗粒，在鸟 类中则为蛋白体(Proteinbody),其大小形态与前后染色粒不易区分，另一种主要在 两栖类发现，着丝粒和其两侧相邻的染色粒彼此融合而成染色粒棒 (Chro-momerebar)。先前的报道表明着丝粒颗粒和染色粒棒上均无侧环，最近的 报道称某些鸟类的蛋白体有短的侧环产生。关于端粒(Telomere)的观察主要来自 鸟类，在姐妹染色单体的末端分别形成端粒环(由染色单体的末端插入邻近的染 色粒所致)，通常情况下，端粒环是开放的，也存在一个插入一个开放的形式， 其大小和长度具物种的特性。端粒环两侧无侧环，鸡的端粒环含有2个转录单元， 关于LBCs着丝粒和端粒可以转录在欧洲水蛙中也得到证实，一些串联重复序列 可以在该类结构中大量转录。球体(Sphereorganelles)是LBCs上另一个重要标志， 有染色体的特异性，相当于一般染色体的次级缢痕。其直径一般2~10pm,-般包含 24个以上这些结构由于在序列组成、位置、结合蛋白以及形成的高级结构上具有 染色体或物种的差异，结合LBCs的长度差异，现在巳经绘出了多种两栖类和鸟 类的LBCs细胞图m;利用细菌人工染色体-荧光原位杂交(BAC-FISH)技术绘制了 鸡LBCs着丝粒区的精细物理图谱,以上这些工作为利用LBCs进行基因组/杂种鉴 定、精细遗传/物理图谱绘制、基因定位、转录和转录机制等研究工作奠定了基 础。

1.2灯刷染色体的转录与转录进程 研究表明转录主要发生在LBCs的侧环上，大量的新生转录产物和相 关蛋白结合，形成了光镜下可见的RNP基质。每个侧环由1至数个转录单位组成， 所以LBCs上单个转录单位是可视的，这使得它们成为在结构和分子水平上研究 转录及其调控机制的优异材料。侧环的类型因RNP基质的大小和类型可以大致分 为正常的大环型、颗粒型、球型和块状(Lumpy),它们都是以30nmRNP颗粒为基础逐渐装配而成，为了探明不同结构的侧环与转录活性的关联，对典型的侧环如球 型侧环利用放射自显影、转录抑制子结合大分子扩散分析技术进行RNA合成的分 析，结果表明在这类侧环中，存在RNA的合成；
侧环的延伸与转录活性相关，活 性高的时候，侧环增大，活性降低时，侧环回缩到染色粒中；
有的侧环中存在数 个不同外形的转录单元，这几个转录单位的转录存在速度的差异。用RNA前体标 记物作为探针进行原位杂交试验，与大环和颗粒状的侧环相比，球型侧环标记的 速度和强度均较弱，推测不同侧环可能具有相异的转录模式，这个问题有待进一 步阐明。已有的报道表明不同侧环的演化存在关联性，这同样也可以看作是转录 后的调控。电镜实验证明了这些类型的侧环都是由30nmRNP颗粒组成的；
热休 克(Thermicshock)实验结练显示在低温处理下，趋于向高级侧环结构发展，两在 高温处理下，则趋于向去凝缩方向发展；
免疫实验也证明侧环形态的多样性与特 异蛋白存在关联。例如在蝾螈的卵细胞中发现一个82kDa核蛋白，利用单抗进行 原位杂交试验表明可以和所有类型的侧环结合,但是并不同步。比如，当球状侧 环被强烈标记时，大环和颗粒环不被标记，当标记出现在核质中时，所有类型的 环不被标记，该结果初步证明了特异的蛋白与侧环的结构演变存在关联。

来自鸟类的实验表明，侧环中一个转录单位约1-40pm，这些被转录的 基因包括了编码棊因和非编码基因。一个令人吃惊的事实是一些持象基因在 LBCs的转录是被抑制的，比如在鸟类|中编码18S、5.8S和28S的基因簇是没有活 性的，但散布的该类基因仍然可以被RNApolII转录而不是polI[19]。迄今为止， 在两栖类和鸟类LBCs的研究中，发现仅有少数单拷贝基因在此时转录。比如在 两栖类LBCs中，已经证实细胞内编码角蛋白(Cytokeratin)、核仁蛋白N038/B23、 c-myc和Egl的基因是转录的，并发现了它们的转录产物向核质转移基于 DNA/RNA杂交技术的染色体涂抹技术(Chromosomepaintingtechnique)使大规模 研究LBCs的转录成为可能，利用改良的该技术BAC-FISH发现许多鸟类LBCs单 拷贝的基因可能是转录的。但问题是BAC克隆是大片段插人，包含了单拷贝和多 拷贝的信息，所以，要验证更多的单拷贝的表达需要进一步的实验。早期的生化 实验证明LBCs转录的主要是非编码的串联重复序列[21]，进一步的调查是利用原 位杂交实验证明两栖类LBCs转录的主要是一些微卫星序列。值得注意的是来自 鸟类的研究结果，如果出现在侧环中的一个微卫星序列是转录的，那么侧环临近 的染色粒里面的同类微卫星串联簇是不表达的，这个结果表明存在一种未知的调 控机制启动LBCs侧环中微卫星DNA的转录[19]。来自热带爪蟾的研究发现卵母 细胞中还储存大量来自LBCs转录子的稳定内含子(StableintronicsequenceRNA), 这些内含子一直到囊胚期都可以检测到，说明在胚胎发育的早期可能发挥重要作 用关于侧环上转录调控机制的研究，早期提出了“通读假说”(Read-throughhypothesis)1231,该假说认为侧环上转录起始于结构基因的启动 子序列，到了该基因的终止序列后并不停留，而是继续转录下面的非编码序列， 现代遗传学的研究结果否认了该假说。结合基因组和细胞学的证据表明位于鸡 LBCs侧环微卫星序列中的反转录转座子长末端重复序列(LTR)启动了微卫星序 列的转录，这得到了很多来自两栖类实验的证明。如果这个机制是正确的，侧环 的平均长度应该与活跃的LTR启动子的数量呈负相关，这是今后需要阐明的问题 之一。初生的转录产物被与RNA成熟相关的蛋白包被，成为附着于侧环上的RNP 基质，这种独特的结构为在活体条件下研究侧环转录产物的处理和机制提供了平 台。来自生化的证据表明，鸟类LBCs侧环中多数RNP基质含有与RNA成熟相关 的组件，如snRNPs、SC35、hnRNP和3"末端处理相关因子。有些RNP基质中没有 发现snRNPs组件，这可能是由于在相应的微卫星转录产物中缺少典型的剪切位 点所致。

1.3灯刷染色体的作用 自从发现LBCs后科学家一直试图理解发生在侧环上大量且有点随意 转录的意义，很多人认为这种转录或多或少是没有意义的。Davidson于1986年提 出了另一个假说，他认为发生在LBCs上的转录为将来卵母细胞的成熟和胚胎发 育提供必要的转录产物，这一假说越来越为科学家重视。可能存在这种情况， LBCs上的转录产物在核膜破裂前是隔离的，当核膜解体后进入了转录后的切割 程序，形成两类成熟的编码和非编码RNA分子，这种现象在Masi和Johnson研究 LBCs组蛋白的转录过程中被证实。据此推测，成熟编码蛋白质RNA分子可以用 于在胚胎基因组启动表达之前，早期胚胎发育所必需蛋白质的合成。至于大量的 非编码微卫星序列的命运可以用现代分子生物学的信息来解释。在后生动物中， 编码微卫星序列的DNA可以转录形成dsRNA前体，成熟后产生siRNA,这些siRNA 是形成组成型异染色质所必需的。那么，可以推测，在拥有LBCs的动物中，非 编码微卫星序列的转录产物同样可以dsRNA前体形式储存在卵细胞中，为早期胚 胎发育提供siRNA以便维持异染色质的稳定，这种假设的前提是要探明微卫星 RNA产物能否出现在受精之后胚胎发育的过程中。

值得注意的是拥有典型LBCs的生物胚胎发育过程大部分时间是离体 发育，这与胎生的哺乳动物在发育环境上存在巨大差异，因此，在这类生物中 LBCs转录与离体后胚胎发育过程是否存在更密切的关联性是值得深人探讨的。

1.4灯刷染色体的表观遗传修饰与染色质重塑通过对两栖类和鸟类灯刷染色体的深人研究，我们基本了解了其整体 表观遗传的状态。来自两栖类的研究发现这类染色体中包括染色粒和侧环不但缺 少组蛋白H1,而且组蛋白H4都呈高度乙酰化状态，这是典型基因组DNA转录活化 的特点，实验证明，乙酰化和甲基化修饰组蛋白的尾部都会导致侧环相应状态的 改变。关于对LBCs表观遗传修饰的理解一个典型的例子是来自于对6种鸟类卵母 细胞LBCsZW的研究。鸟类卵母细胞中性染色体ZW是一个仅通过着丝粒处相连 的不对称二价体，Z染色体具有正常的LBCs形态，而富含重复序列的W则仅形成 几个较大的染色粒，含有少量的侧环。进一步的研究发现W染色体具备了惰性染 色体的特点，比如缺少乙酰化组蛋白H4,富含组蛋白H3K9和H3K27的二甲基化， 几个大的染色粒都含有大量的异染色质蛋白1。这些因素共同导致了W染色体在 鸟类卵母细胞的发育中髙度凝缩的状态。

尽管现在从整体上对LBCs的表观修饰有了一定的理解，但对该类染 色体的“建立-维持-再凝缩”的机制了解很少。一个重要的事实是在两栖类和鸟类 的LBCs上，不但缺少组蛋白H1，而且也未见参与减数分裂染色质凝缩的拓朴异 构酶II。另外一个在维持LBCs形态方面发挥重要作用的蛋白是染色体结构维持 (Structuralmaintenanceofchromosomes,SMC)蛋白家族，它们参与了黏连(Cohesin) 复合体和凝缩(Condensin)复合体的形成。电镜结合免疫实验证明黏连复合体主要 出现在姐妹染色单体两条染色质丝形成的轴上，后者主要在染色粒上发现。这说 明，这两种复合体可能对维持LBCs的染色粒-侧环结构发挥重要作用[27]。最新 的关于LBCs重建的实验来自将人类的精子注射进两栖类动物非洲爪蟾的卵母细 胞中，结果发现精子染色体形成了典型的LBCs结构，这一方面说明了两栖类动 物卵母细胞中含有重塑哺乳动物非活性染色体的所有因素，另一方面也说明哺乳 动物卵母细胞染色体的失活并不是永久的遗传或表观遗传机制造成的。这个实验 为进一步鉴定染色质重塑相关的顺式和反式作用因子以及解析其机制提供了研 究材料。

2灯刷染色体应用于遗传学教学的现状与思考 对于遗传学内容的传授离不开优秀的案例，生命科学的飞速发展也使 得这些案例的内涵得到了丰富和扩展。以优秀案例开展遗传学教学工作可以将复 杂的遗传学知识形象化和简单化，便于教师的讲授和学生的理解与记忆[3]，同 样也可以使枯燥的遗传学学习变得妙趣横生。LBCs就是遗传学的一个优秀经典 的案例，但在遗传学教学中出镜偏低。在我们教学所使用戴灼华等编写的《遗传 学》课本中，以LBCs为案例介绍的内容很少，仅在第二版第二章《遗传的细胞学基础》中，作为一种特殊染色体形态进行了简单介绍，一句“LBCs是在光学显 微镜下直接观察并识别特殊位置上的单个基因转录活性极为理想的材料”让学生 对该案例充满了遐想和期待，但本书后面的遗传学内容均没有发现该案例的身影， 因此发掘和使用LBCs案例应用于遗传教学有十分重要的意义。

2.1灯刷染色体在遗传学教学中的拓展 以LBCs为案例进行相关遗传学内容教学，我们应首先根据高校遗传 学的培养目的和教学目标，在学生掌握了一定的细胞、生化和遗传知识的基础上， 结合遗传学的进度逐步有序地加以介绍。