[光谱法研究金属离子与肿瘤抑制蛋白p53的DNA结合]离子光谱

光谱法研究金属离子与肿瘤抑制蛋白p53的DNA结合

【关键词】 金属离子, 蛋白结构, 亲和性, 疏水性, 荧光光谱 1 引 言 自然界中大约1/4的蛋白需要金属离子的协助才能发挥正常功能[1,2]。

肿瘤抑制蛋白p53是zn2+结合蛋白，它调控很多重要的生物学过程[3]。p53响应 于多种dna损伤事件，被激活后作为一个转录因子进一步激活下游基因，从而可 以导致细胞周期停留在g1/s期修复或者诱导凋亡[4]。所有这些已知的生物学功能 都依赖于其dna结合特性[5]。wwW.133229.COm野生型p53通过一个序列特异性 的dna结合结构域(p53dbd)来结合dna[6]。p53基因在50%肿瘤中发生突变[7]，而 这些突变主要发生在p53dbd，突变的p53不能激活下游基因转录[8]。因此，p53dbd 结合和转录激活活性是p53最关键的生物学功能。晶体结构研究结果表明，p53 核心结构域结构为β  三明治结构形成脚手架，支撑2个大环和1个环  片层  螺 旋模序。2个大环形成空腔结合zn2+，而环  片层  螺旋模序形成p53dna结合表 面。p53dbd上的3个半胱氨酸(cys176, cys238和cys242)和1个组氨酸(his179)结合1 个zn2+[9]。zn2+的结合被认为是p53核心结构域正确折叠所必需的，这种结合如 果被破坏将会使p53dbd减弱甚至失去dna结合和转录下游基因的功能[10]。核磁共 振研究表明：在没有zn2+的情况下，p53蛋白的dna结合表面发生了结构变化;荧 光各向异性研究表明：zn2+的去除使p53dbd失去了位点特异性的dna结合活性， 但保留着非特异性的dna结合活性[11]。另外，cu2+结合p53蛋白，却导致p53构 象和dna结合活性的破坏[12]。然而，金属离子与p53dbd的结合平衡的研究尚未见 报道。

细胞内存在多种金属离子，为了研究这些金属离子是否结合并影响p53dbd，本实验克隆并纯化了p53dbd蛋白，并在体外应用光谱法研究这些金属离 子与p53dbd蛋白的结合反应，以及金属离子对蛋白结构及表面疏水性的影响。

2 实验部分 2.1 仪器与试剂 f  4500荧光分光光度计(日本日立公司);
jasco j  715分光偏振计(日 本分光株式会社)。8  苯胺  1  萘磺酸(ans，sigma公司);二硫苏糖醇(dtt，merck 公司);nacl(天津市试剂六厂);蔗糖、乙二胺四乙酸(edta)、异丙基  β  d  硫代半 乳糖苷(iptg)、丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(sds)、四甲基乙二胺(temed)、tris  base 及咪唑均购于北京鼎国试剂公司;zncl2, mgcl2, cacl2, fecl3, mncl2, cocl2, cucl2, bacl2及nicl2均购于天津大学科威公司。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯。

实验用水为二次蒸馏水。

高渗缓冲液a(20 mmol/l tris  hcl，2.5 mmol/l edta，200 g/l 蔗糖，ph 8.0);低渗缓冲液b(20 mmol/l tris  hcl，2.5 mmol/l edta，ph 8.0);缓冲液c(20 mmol/l tris  hcl，50 mmol/l nacl，2 mmol/l cacl2，ph 8.0);缓冲液d(0.5 mol/l nacl，20 mmol/l tris  hcl，5 mmol/l 咪唑，ph 8.0);缓冲液e(0.5 mol/l nacl，20 mmol/l tris  hcl，80 mmol/l 咪唑，ph 8.0);缓冲液f(0.5 mol/l nacl，20 mmol/l tris  hcl， 300 mmol/l 咪 唑，ph 8.0);缓冲液g(50 mmol/l tris  hcl，100 mmol/l nacl，1 mmol/l dtt，ph 7.5)。

2.2 p53dbd的基因克隆、蛋白表达与纯化 利用密度梯度离心法从人全血中分离单个核细胞，然后使用trizol法从 单个核细胞中提取总rna。以5′  tcccaagcaatggatgat  3′和 5′  tttatggcgggaggtaga  3′为引物，通过rt  pcr方法从总rna中克隆出肿瘤抑制蛋 白p53cdna片段。然后以5′  atcgtctcccatggctgtcccttcccagaaaa  cct  3′和 5′  atatctcgagtcacagtgctcgcttagtgctc  3′为引物pcr编出氨基酸96～308的p53dbd基 因片段。这个基因片段被克隆进表达载体pet32a(novagen)。重组质粒通过碱裂解 法制备，测序证明插入序列的正确性。核心的dna结合结构域在escherichia coli bl21 (de3) trx b-中过量表达。细菌在lb培养基中37 ℃培养直到吸光度值a600达到 0.6～1.0。用0.25 mmol/l异丙基  β  d  硫代半乳糖苷(iptg)诱导重组蛋白的表达， 25 ℃条件下继续孵育6 h。后续的步骤都在4 ℃下进行。离心收集菌体，然后重 悬于高渗缓冲液a中30 min。离心重新收集后，细菌溶解在低渗缓冲液b中裂解45 min。不溶物以13000 r/min离心30 min去除。蛋白上清液用缓冲液c透析12 h，然后流经缓冲液d平衡的亲和色谱柱(qiagen)。色谱层析后用缓冲液e清洗杂蛋白， 用缓冲液f洗脱重组蛋白。洗脱的蛋白组分利用sds  page检测。重组的p53dbd蛋 白进一步利用sephadex g  75凝胶过滤柱(pharmacia)于缓冲液c中纯化。从凝胶过 滤柱中收集的蛋白用肠激酶在25 ℃下酶切7 h。酶切蛋白再次利用sephadex g  75凝胶过滤柱于缓冲液g(50 mmol/l tris  hcl, ph 7.5, 100 mmol/l nacl, 1 mmol/l dtt)中进一步纯化。纯化的p53dbd蛋白用2.5 mmol/l edta处理以去除zn2+，然后流 经sephadex g  75凝胶柱更换缓冲液为缓冲液g。最后sds  page电泳检测纯度， 运用bradford法以牛血清白蛋白为标准测定蛋白浓度。

2.3 荧光滴定 在室温条件下，以295 nm为激发波长，记录310～450 nm的发射谱。

激发和发射的光谱带宽设置为5 nm，每个数据点测量3次。蛋白浓度为1.8 μmol/l， 滴定反应于缓冲液g中进行。每个数据点都扣除背景，作荧光校正。

2.4 圆二色谱研究 圆二色谱测量在jasco j  715分光偏振计上进行，以1 mm石英比色皿 为样品池，扫描波长范围为200～250 nm。每一个数据点取6次扫描的平均值。100 μmol/l金属离子与4.0 μmol/l蛋白结合反应于缓冲液g中进行。每个数据点都通过 减去背景谱校正。

2.5 ans结合研究 通过测量ans的荧光增强来测量ans(8  苯胺  1  萘磺酸)与p53dbd的 结合。100 μmol/l金属离子与1.8 μmol/l蛋白于缓冲液g中温浴30 min后，加入50 μmol/l ans，然后测量ans荧光光谱。激发波长设置为380 nm，发射谱扫描400～600 nm。所有的测量都通过减去缓冲液背景进行荧光校正。

3 结果与讨论 3.1 p53dbd表达、纯化以及内源的荧光性质 为了研究不同金属离子与p53dbd的结合反应，本实验克隆、表达并纯 化了编码96～308氨基酸的p53dbd蛋白。sds  page分析表明，24 kda的p53dbd蛋 白在纯化的部分中占主要部分(图1a)。蛋白的浓度为170 mg/l。图1b表示在室温 条件下纯化的p53dbd蛋白于标准缓冲液g中的荧光发射谱。激发波长为295 nm，在此波长下只有色氨酸被激发。根据文献[13]报道，当发射谱最大波长在330～ 332 nm之间，表示色氨酸残基埋藏在蛋白的非极性区域内;当发射谱最大波长在 340～342 nm之间，说明色氨酸残基固定在蛋白的表面并且与水接触受限;当发射 谱最大波长在350～353 nm之间，表示色氨酸残基完全暴露于水中。分析p53dbd 的荧光发射光谱表明重组蛋白在295 nm被激发时，最大发射波长为340 nm。这与 p53dbd晶体结构色氨酸位于蛋白表面的结果相一致[9]。当p53dbd蛋白用4.2 mol/l 盐酸胍处理1 h后，最大发射波长红移到352 nm，同时荧光强度降低，说明色氨 酸残基转移到一个更强极性的环境之中。

3.2 金属离子与肿瘤抑制蛋白p53dbd的结合 金属离子与p53dbd结合的定量测量可以通过测量p53dbd荧光光谱的 变化来完成。文献[14] 已报道金属离子的结合能够导致荧光发射强度的降低。

本实验观测到p53dbd的荧光强度随着9种金属离子滴定的进行而逐渐减弱(图2a)。

金属离子与蛋白的结合通常可以分为动态猝灭和静态猝灭这两种。动态猝灭涉及 到在激发态短暂存在的瞬间荧光团与猝灭剂的接触。动态猝灭和静态猝灭都可以 用stern  volmer方程来描述。f0/f=1+kqτ0[q]=1+ksv[q](1)f和f0分别表示在有和无 猝灭剂存在的情况下，p53dbd蛋白的荧光强度。kq是生物分子的猝灭速率常 数;ksv是stern  volmer猝灭常数;τ0是生物分子在没有猝灭剂的情况下的平均寿 命;[q]是猝灭剂的浓度。可以通过式(1)直线的斜率得到ksv(图2b)。根据文献[15] 报道，生物分子的τ0值约为10-8 s，因此可以计算出猝灭速率常数kq，其值列于 表1中。生物分子与不同的猝灭剂所产生的最大碰撞猝灭常数为2.0×1010 l/(mol·s)[16]。从表1可见，9种金属离子导致p53dbd荧光猝灭的速率常数远大于 碰撞猝灭常数。这些数据说明荧光猝灭是静态猝灭。

fig.2 a. fluorescence emission spectra of 1.8 μmol/l p53dbd treated with increasing amounts of ba2+;
b. stern  volmer plots of fluorescence quenching of p53dbd with ba2+;
c. logarithmic plots of fluorescence quenching of p53dbd treated with ba2+静态猝灭涉及荧光团  猝灭剂复合物的形成。在一个静态猝灭过程中， 假设p53dbd蛋白上有n个配体结合位点，猝灭反应可以表示为方程(2)。

[p53dbd]和[q]分别表示自由蛋白和配体的浓度，[qn·p53dbd]表示蛋白 复合物的浓度。总蛋白浓度等于自由蛋白与蛋白复合物浓度之和，因此，方程(3) 可以变为方程(4)。

ka=[p53dbd]tot-[p53dbd][q]n·[p53dbd](4)体系中，荧光强度与蛋白浓度成正比，所以 lgf0-ff=lgka+nlg[q](6) 在此方程中，n表示结合位点数。ka和n可以通过线性关系lg(f0-f)/f对 lg[q]的截距和斜率得到[17](图2c)。

从表1中可以看出，金属离子结合p53dbd蛋白亲和性依次为 fe3+zn2+cu2+ca2+mg2+ba2+mn2+ni2+co2+。表1 金属离子与p53dbd的结合常数 (ka)、解离常数(kd)、结合位点数(n)以及猝灭速率常数(kq) 3.3 p53dbd二级结构的变化 内源荧光变化表示了色氨酸残基局部微环境的变化在一定程度上反 映了p53dbd三级结构的变化。采用远紫外圆二色谱测量金属离子对p53dbd蛋白二 级结构的影响(图3)。p53dbd远紫外圆二色谱曲线在208和220 nm处表现出2个负 的特征峰，这是蛋白质α  螺旋典型的特征峰。ba2+, ca2+, co2+, mn2+及ni2+并 不引起p53dbd蛋白二级结构变化。

图3 蛋白与金属离子作用的远紫外圆二色谱 1. p53dbd;
2. (1)+mg2+;
3. (1)+zn2+;
4. (1)+fe3+;
5. (1)+cu2+.而zn2+, mg2+, fe3+和cu2+结合p53dbd蛋白，引起圆二色谱两个负的特征峰值的降低，说 明这些离子的结合导致了蛋白螺旋结构降低(图3)。zn2+, mg2+和fe3+作用相对较 弱，引起蛋白螺旋结构的细微改变。zn2+结合p53dbd使得蛋白上的两个大环连接 在一起，从而进行dna特异性结合[11]。而cu2+作用引起了蛋白螺旋结构大量丢 失，这与文献[12]报道的cu2+结合p53导致p53构象和dna结合活性的破坏相一致。

3.4 p53dbd疏水性研究 考察了结构荧光探针与p53dbd的结合。ans在水相缓冲液中荧光较弱， 但是结合蛋白疏水区域后其荧光发射谱显著增强。因此，可以通过测量ans的荧 光变化研究p53dbd蛋白的疏水性变化[18]。图4a表示的是ans与p53dbd结合后的荧 光光谱图，其激发波长为380 nm，最大发射波长为478 nm。当p53dbd蛋白与不同 金属离子结合以后，其ans荧光有不同程度的增强。从图4b可见，ba2+, ca2+, co2+, mn2+及ni2+并没有引起p53dbd疏水性显著变化，zn2+, mg2+和cu2+结合诱导蛋白 表面疏水性增强，而fe3+引起了p53dbd蛋白表面疏水性降低。p53dbd的晶体结构 表明[9]，p53核心结构域结构为一个β  三明治结构形成脚手架，支撑2个大环和 1个环  片层  螺旋模序。2个大环形成空腔结合zn2+，因此zn2+结合诱导蛋白表面疏水性增强。

4 结 论 综合以上实验结果，ba2+, ca2+, co2+, mn2+及ni2+虽然结合p53dbd蛋 白，但是并未引起蛋白结构和疏水性的改变;zn2+结合p53dbd蛋白诱导蛋白结构 细微调整，并引起表面疏水性增强，使得蛋白上的2个大环连接在一起，从而具 备dna特异性结合活性;cu2+结合导致蛋白螺旋结构大量丢失，破坏p53构象和dna 结合活性;mg2+和fe3+都能诱导蛋白结构细微调整，mg2+诱导蛋白表面疏水性增 强，其作用方式可能与zn2+类似，而fe3+导致p53dbd蛋白表面疏水性降低。因此， mg2+和fe3+可能是影响或调节p53活性的潜在因子之一。